[發明專利]一種5-甲基四氫葉酸產量提高的枯草芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202010096078.3
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111172091B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 劉延峰;劉龍;楊晗;李江華;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/54;C12P17/18;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種5?甲基四氫葉酸產量提高的枯草芽孢桿菌及其應用，屬于基因工程領域。本發明通過代謝改造對DHF合成途徑進行強化，增加前體供給；再通過將dCas9蛋白整合到枯草芽孢桿菌基因組中，并誘導表達dCas9蛋白與關鍵基因序列中的sgRNA結合，阻斷前體供給途徑、競爭途徑及分解代謝途徑中的關鍵基因的轉錄起始，使基因表達水平下調，得到的一株高產5?MTHF的重組菌株，產量達到1.58mg/L，是出發菌株的3.9倍，為枯草芽孢桿菌代謝工程高效生產5?MTHF奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種5-甲基四氫葉酸產量提高的枯草芽孢桿菌及其應用，屬于基因工程領域。

背景技術

L-5-甲基四氫葉酸(L-5-MTHF)是葉酸在人體內發揮作用的惟一活性形式，是葉酸類藥物中唯一能透過血腦屏障的藥物。葉酸是所有細胞中一碳代謝的輔助因子，它們參與核苷酸的生物合成，葉酸水平不足會使細胞分裂時間延長，從而導致巨幼細胞性貧血；葉酸缺乏還可能導致多種疾病，如孕婦早期自然流產或未出生嬰兒脊柱裂和無腦畸形等神經管缺陷(NTD)、聽力損失、阿爾茲海默癥，心血管疾病等，也會增加癌癥的風險。盡管葉酸在人類飲食中無處不在，葉酸缺乏的問題仍然影響著全球數十億人，葉酸作為食品添加劑已經成為必需品，成人建議攝取葉酸400微克/天，因此導致葉酸的市場需求不斷增長。目前5-MTHF生產主要以工業合成為主，但是存在拆分工藝復雜，難以純化等問題。而且其前體物質葉酸也是通過工業化學合成生產，會對環境造成污染。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級別，Bacillus subtilis中存在合成5-MTHF的內源途徑，因此運用代謝工程手段構建重組枯草芽孢桿菌是生產食品安全級5-MTHF的有效途徑。然而，枯草芽孢桿菌野生型菌株產量極低，5-MTHF及其中間代謝產物參與途徑繁多復雜，傳統理性代謝工程調節效率較低。首先強化DHF合成途徑，增加前體供給，再利用CRISPRi系統可同時對多個基因的表達進行單獨抑制及組合抑制，提高了代謝改造的效率。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高產5-MTHF的重組枯草芽孢桿菌菌株及其構建方法。構建方法是在低產5-MTHF重組菌株基因組中利用P43強啟動子過表達對氨基苯甲酸酯合酶(A亞基)(編碼基因pabB)，GTP環化水解酶IA(編碼基因folE)，鋅非依賴性GTP環化水解酶IB(編碼基因yciA)，強化DHF合成途徑，增加前體供給；再將dCas9蛋白整合到枯草芽孢桿菌基因組中，并誘導表達dCas9蛋白與關鍵基因序列中的sgRNA結合，阻斷基因的轉錄起始，使基因表達水平下調，最終實現對競爭和分解代謝途徑等的抑制而提高5-MTHF產量。

本發明的第一個目的是提供一種產5-MTHF的重組枯草芽孢桿菌，強化了DHF合成途徑，并抑制中心代謝途徑、嘌呤代謝途徑、泛酸代謝途徑和競爭代謝途徑中一個或多個關鍵基因的表達。

在一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌的出發菌株為B.subtilis A10，已公開于公開號為CN109652351A、發明名稱為“一種高產5-甲基四氫葉酸重組枯草芽孢桿菌及其應用”的專利申請中；所述強化DHF合成途徑是過表達所述DHF合成途徑中的對氨基苯甲酸酯合酶A亞基、GTP環化水解酶IA、鋅非依賴性GTP環化水解酶IB。

在一種實施方式中，利用P43強啟動子過表達編碼對氨基苯甲酸酯合酶(A亞基)的基因pabB，編碼GTP環化水解酶IA的基因folE和編碼鋅非依賴性GTP環化水解酶IB的基因yciA，以強化DHF合成途徑，增加前體供給。

在一種實施方式中，所述抑制中心代謝途徑、嘌呤代謝途徑、泛酸代謝途徑和競爭代謝途徑中一個或多個關鍵基因的表達，是將dCas9蛋白整合到枯草芽孢桿菌基因組中，并誘導表達dCas9蛋白與關鍵基因序列中的sgRNA結合，阻斷基因的轉錄起始，使基因表達水平下調，實現對競爭和分解代謝途徑等的抑制而提高5-MTHF產量。