[發明專利]一種5-甲基四氫葉酸產量提高的枯草芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202010096078.3
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111172091B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 劉延峰;劉龍;楊晗;李江華;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/54;C12P17/18;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.一種產L-5-甲基四氫葉酸的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，強化DHF合成途徑，并通過CRISPRi系統抑制中心代謝途徑、嘌呤代謝途徑、泛酸代謝途徑和競爭代謝途徑中一個或多個關鍵基因的表達；所述強化DHF合成途徑是過表達DHF合成途徑中的對氨基苯甲酸酯合酶A亞基基因pabB、GTP環化水解酶IA基因folE、鋅非依賴性GTP環化水解酶IB基因yciA；

所述中心代謝途徑的基因包括：調控參與5-MTHF前體磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸合成的基因pyk和tkt；

所述嘌呤代謝途徑的基因包括：調控參與嘌呤代謝的5-MTHF前體10-甲酰四氫葉酸和5,10-亞甲基四氫葉酸的基因thyA；所述基因thyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

所述泛酸代謝途徑包括：調控參與泛酸代謝前體5,10-亞甲基四氫葉酸的基因panB和ykpB，所述基因panB的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示，所述基因ykpB的核苷酸序列如SEQID NO.45所示；

所述競爭代謝途徑的基因包括：調控核黃素競爭前體GTP合成的基因ribA，調控參與芳香族氨基酸競爭前體分支酸合成的基因pheA，tyrA和trpE；所述基因ribA的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.26所示；所述基因tyrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述基因trpE的核苷酸序列如SEQ IDNO.32所示。

2.根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，編碼所述對氨基苯甲酸酯合酶A亞基、GTP環化水解酶IA、鋅非依賴性GTP環化水解酶IB的基因重組于基因組上，并利用P₄₃啟動子整合表達。

3.根據權利要求1或2所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，以枯草芽孢桿菌A10為出發菌株。

4.一種構建權利要求1～3任一所述重組枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將編碼對氨基苯甲酸酯合酶A亞基的基因pabB整合到枯草芽孢桿菌A10基因組中；

(2)將編碼GTP環化水解酶IA的基因folE整合到步驟(1)構建的枯草芽孢桿菌基因組中；

(3)將編碼鋅非依賴性GTP環化水解酶IB的基因yciA整合步驟(2)構建的枯草芽孢桿菌基因組中；

(4)將dCas9蛋白整合到步驟(3)構建的枯草芽孢桿菌基因組中；

(5)將sgRNA嵌合體通過Gibson連接的方式插入pHT01質粒中；

(6)分別將基因pyk，tkt，purN，purH，thyA，panB，ykpB，ribA，pheA，tyrA和trpE序列中的sgRNA以設計引物的方式單獨插入步驟(5)構建的pHT01質粒的sgRNA嵌合體中；

(7)將步驟(6)構建的pHT01質粒轉化入步驟(4)構建的含有dCas9蛋白的重組枯草芽孢桿菌中。

5.權利要求1～3任一所述的重組枯草芽孢桿菌在生產L-5-甲基四氫葉酸及其衍生產品中的應用。

6.一種生產L-5-甲基四氫葉酸的方法，其特征在于，將權利要求1～3任一所述的重組枯草芽孢桿菌接種至發酵培養基中，于30～37℃發酵4～6h后，加入木糖，繼續發酵。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述接種是接種重組枯草芽孢桿菌的種子液；所述種子液按如下方法制備：將重組枯草芽孢桿菌單菌落接種至種子培養基中，于30～37℃、200～220rpm培養8～10小時。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，于30～37℃發酵4～6h后，加入終濃度為10～15g/L木糖，繼續發酵至少10h。

9.權利要求6～8任一所述的方法在生產含L-5-甲基四氫葉酸或其衍生物的食品、藥品、保健品方面的應用。