[發明專利]一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法

有效

• 申請號: 202010095710.2
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111172252B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 肖先金;明志浩;章偉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/682;C12Q1/6827
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于DNA序列檢測技術領域，公開了一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法，對不同突變位點的基因序列，設計相應的Guiding鏈；合成制備所需的Guiding鏈；將Guiding鏈與探針檢測體系混合，使Guiding鏈與底物鏈的比例為2:1；向上述混合體系加入Endo IV，使底物鏈轉化為長度更長的DNA雙鏈，并進行實時熒光測定。本發明涉及的調控內切酶IV/APE?1/lambda外切酶活性，降低了由于核酸酶副活性而產生的背景信號，同時最大程度的保留核酸酶切割目標序列的主活性，從而提高檢測效能。

技術領域

本發明屬于DNA序列檢測技術領域，尤其涉及一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法。

背景技術

目前，核酸酶是生物學、化學和醫學研究中被廣泛使用的工具。它們被廣泛應用于生物傳感器、基因編輯技術和新藥物的研制上。不同的核酸酶具有不同的切割特性，對應的底物也各不相同。在實際應用的層面，目前對核酸酶的應用都是基于其可以預測的工作機制。例如，我們通常希望Endo IV能夠穩定且專一地切割具有空位的DNA雙鏈。然而，核酸酶容易受到體系中其他核酸鏈的干擾，其切割特性并不穩定。尤其是對于以雙鏈DNA為靶目標鏈的核酸酶，它們經常非特異性地切割核酸單鏈。這一現象往往導致意料之外的串擾，對核酸酶在各個領域的應用形成很大的限制。

在酶-核酸探針領域，廣泛使用的lambda exonuclease，APE1和Endo IV均易發生預料之外的非特異酶切現象，嚴重限制了酶-探針檢測體系的實際應用。因為在酶-探針檢測體系中，不與野生鏈結合的核酸探針以單鏈的形式大量存在。如果核酸酶切割單鏈核酸探針，熒光信號就會作為背景信號大量產生，導致突變鏈和野生鏈之間的區分度減少甚至消失。這對于一個檢測體系來說是不可接受的。針對這一問題，目前并沒有簡明有效的方法。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：(1)核酸酶切割單鏈的現象普遍存在且嚴重干擾酶-核酸探針體系的正常工作，降低檢測效能；

(2)該現象難以預測，目前的方法只能是盲目的優化探針序列以盡可能地避免核酸酶對單鏈探針的自切割，導致成本極高。

解決以上問題及缺陷的難度為：核酸酶在DNA雙鏈和DNA單鏈上的分配機理尚不明確。抑制核酸酶副活性的同時需要保持核酸酶主活性不受影響。

解決以上問題及缺陷的意義為：提供了一種全新的抑制核酸酶副活性的方法，擴大了核酸酶的應用范圍；保證酶-探針體系正常工作，使檢測效能保持穩定；避免當前方法中盲目優化探針序列的環節，降低了成本。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供了一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法。可應用于核酸信號放大、單核苷酸多態性(SNP)分型以及低豐度點突變檢測等技術領域。

本發明是這樣實現的，一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法，在抑制核酸酶副活性的同時不影響核酸酶主活性，保證酶-探針體系正常工作，使檢測效能保持穩定，包括：

步驟一，對不同突變位點的基因序列，設計相應的Guiding鏈；

步驟二，合成制備所需的Guiding鏈；

步驟三，將Guiding鏈與探針檢測體系混合，使Guiding鏈與底物鏈的比例為2:1；

步驟四，向上述混合體系加入Endo IV，使底物鏈轉化為長度更長的DNA雙鏈，并進行實時熒光測定。

進一步，步驟一設計Guiding鏈的方法包括：

步驟1，確定底物鏈的探針雜交域，所述底物鏈為待檢測的目標序列；

步驟2，設計兩條DNA單鏈，所述DNA單鏈為Guiding鏈，使兩條Guiding鏈其與底物鏈的探針雜交結構域外的部分互補，一起構成核酸酶優先結合的長雙鏈結構。