[發明專利]一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法

有效

• 申請號: 202010095710.2
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111172252B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 肖先金;明志浩;章偉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/682;C12Q1/6827
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，所述對核酸酶活性進行特異性調控的方法包括：

步驟一，對不同突變位點的基因序列，設計相應的Guiding鏈；

步驟二，合成制備所需的Guiding鏈；

步驟三，將Guiding鏈與探針檢測體系混合，使底物鏈轉化為長度更長的DNA雙鏈，Guiding鏈與底物鏈的比例為2:1；

步驟四，向包含Guiding鏈和探針檢測體系的混合體系中加入Endo IV，并進行實時熒光測定；

步驟一設計Guiding鏈的方法包括：

步驟1，確定底物鏈的探針雜交域，所述底物鏈為待檢測的目標序列；

步驟2，設計兩條DNA單鏈，所述DNA單鏈為Guiding鏈，使兩條Guiding鏈其與底物鏈的探針雜交結構域外的部分互補且探針與Guiding鏈之間無堿基間隙，一起構成核酸酶優先結合的長雙鏈結構。

2.如權利要求1所述的對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，Guiding鏈的長度大于20-nt。

3.如權利要求1所述的對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，若突變位置過于靠近底物鏈5’或3’端，只引入一條Guiding鏈與底物雜交結構域外互補。

4.如權利要求1所述的對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，步驟2對核酸酶活性進行調控的方法包括：

步驟I，設計反應體系，合成制備寡核苷酸鏈；反應體系包括核酸酶，探針，緩沖液，H₂O和雙鏈DNA；探針序列為SEQ ID NO：1，引物序列為SEQ ID NO：2，雙鏈DNA為序列包括SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4；

步驟II，配置反應體系，在400uL酶標條中，加入100nM探針，5uL ThermoPol緩沖液，0.1單位Endo IV或2單位APE-1或2單位lambda exo，并用去離子水補齊到50uL總體積；

步驟III，向上述反應體系中加入不同量，不同長度的雙鏈DNA，放入熒光檢測儀器中，進行實時熒光測定;

熱程序：37℃，每20s測定一次熒光值。

5.如權利要求1所述的對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，步驟四進行實時熒光測定的方法進一步包括：

步驟i，設計反應體系，合成制備寡核苷酸鏈，靶標為EGFR-L858R突變，依據該突變的DNA序列，設計Endo IV參與的核酸檢測體系所需的底物鏈MT序列為SEQ ID NO：6，WT序列為SEQ ID NO：7；探針probe，探針序列為SEQ ID NO：1，阻斷鏈blocker序列為SEQ ID NO：5以及相應的Guiding鏈序列包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9；

步驟ii，配置反應體系,在400uL酶標條中，加入100nM probe，1000nM MT/WT，2000nMblocker， 5uL ThermoPol緩沖液，0.1單位Endo IV，向其中一組加入2000nM Guiding-1，2000nM Guiding-2，另一組不加，兩組均用去離子水補齊到50uL總體積；

步驟iii，將上述反應體系迅速放入熒光檢測儀器中，進行實時熒光測定；

熱程序：37℃，每20s測定一次熒光值。

6.如權利要求1所述的對核酸酶活性進行特異性調控的方法，其特征在于，步驟四進行實時熒光測定的方法進一步包括：

步驟（a），設計反應體系，合成制備寡核苷酸鏈；靶標為EGFR-L858R突變，依據該突變的DNA序列，設計Endo IV參與的核酸檢測體系所需的底物鏈MT，WT，探針probe，阻斷鏈blocker以及相應的Guiding鏈；

步驟（b），配置反應體系，不同比例突變體的50μL反應體系：

探針量：1000nM；

突變比例：100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.01%，0%，混合鏈總量均為1000nM；

阻斷鏈量：2000nM；

Guiding鏈量：2000nM；

Endo IV量：0.1單位；

步驟（c），將上述反應體系迅速放入熒光檢測儀器中，進行實時熒光測定;

熱程序：37℃，每20s測定一次熒光值。