[發(fā)明專利]一種用離子轉(zhuǎn)運蛋白促進鈍齒棒桿菌合成L-精氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010095689.6
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111172090B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 饒志明;徐美娟;劉晶;張顯;楊套偉;邵明龍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種用離子轉(zhuǎn)運蛋白促進鈍齒棒桿菌合成L?精氨酸的方法，具體公開了一種通過過表達單價陽離子/H⁺逆轉(zhuǎn)運蛋白Mrp1A以及陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶CTAP1提高L?精氨酸產(chǎn)量的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明成功實現(xiàn)了對基因mrp1和ctap1的敲除和過表達，通過對胞內(nèi)[Na⁺]和[K⁺]的測定，明確離子轉(zhuǎn)運蛋白在離子濃度、pH穩(wěn)態(tài)和滲透壓方面的調(diào)節(jié)作用。采用5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵策略，優(yōu)化發(fā)酵條件，最終重組鈍齒棒桿菌5?5(mrp1ctap1)發(fā)酵至96h，重組菌的L?精氨酸產(chǎn)量達到65.3g/L，產(chǎn)率為0.395g/g，比鈍齒棒桿菌SYPA5?5提高了39.1％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種用離子轉(zhuǎn)運蛋白促進鈍齒棒桿菌合成L-精氨酸的方法，具體公開了一種通過過表達單價陽離子/H⁺逆轉(zhuǎn)運蛋白Mrp1A以及陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶CTAP1提高L-精氨酸產(chǎn)量的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-精氨酸(C₆H₁₄N₄O₂)是一種天然堿性氨基酸，其在食品添加劑、飼料和制藥行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用且有益于人類的生長發(fā)育。L-精氨酸具有多種生理功能與作用，廣泛應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活，是氨基酸工業(yè)研究與開發(fā)的熱點之一。在L-精氨酸合成過程中，離子轉(zhuǎn)運為鈍齒棒桿菌發(fā)酵提供適宜的胞內(nèi)pH環(huán)境，同時維持離子穩(wěn)態(tài)防止胞內(nèi)出現(xiàn)高滲透壓，是保證L-精氨酸高水平產(chǎn)量和產(chǎn)率的關(guān)鍵。

H⁺、K⁺和Na⁺是細菌中最關(guān)鍵、最重要的一價陽離子，在細菌的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此離子在胞內(nèi)外的分布影響著菌體的存活。細菌的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)也在不同的胞外環(huán)境下發(fā)揮作用，如堿性pH和高滲透壓條件。H⁺用于調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH，從而保證適宜的胞內(nèi)環(huán)境。K⁺是胞內(nèi)含量最豐富的離子，參與多種細胞生理活動。其控制質(zhì)膜電位，調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH，激活胞內(nèi)酶。在酸性條件下，鈍齒棒桿菌SYPA5-5的生長完全取決于K⁺的有效性和內(nèi)部積累。此外，K⁺還可以作為一種滲透溶質(zhì)，在高滲透壓脅迫下，許多細菌迅速積累K⁺以恢復(fù)其膨脹壓。Na⁺對細菌細胞的重要性通常歸因于其在溶質(zhì)吸收中的作用。

鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)是一種鈍齒狀、無芽孢的革蘭氏陽性菌，其生長迅速且可廣泛使用不同的有機化合物作為碳源。該菌株不存在L-精氨酸脫氨酶，這使得胞內(nèi)產(chǎn)生的L-精氨酸未被或有限度地被降解，對L-精氨酸的合成具有高效的促進作用，因此其突變株在國內(nèi)的氨基酸生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，但對其遺傳背景的研究還處于空白狀態(tài)。鈍齒棒桿菌SYPA5-5是發(fā)明人課題組篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株(菌株保藏編號為CGMCC NO.0890，在公開號為CN1441055A的專利中已公開)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于利用一種過表達單價陽離子/H⁺逆轉(zhuǎn)運蛋白Mrp1A和陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶CTAP1的重組鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，得到的L-精氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)率均提高，對于規(guī)?；苽銵-精氨酸具有重要的應(yīng)用價值。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種重組鈍齒棒桿菌，是過表達了單價陽離子/H⁺逆轉(zhuǎn)運蛋白Mrp1A和陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

優(yōu)選地，編碼所述Mrp1A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優(yōu)選地，編碼所述CTAP1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述重組鈍齒棒桿菌以pDXW-10作為原始表達載體。