[發(fā)明專利]可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010095003.3
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111440818B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 智海劍;殷金龍;王麗群;劉慧;晉彤彤;李凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/40;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/82;C12R1/01
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發(fā)明公開了可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其應(yīng)用。可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體序列如SEQ ID NO.1所示。所述的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301?SMV(SC7)在侵染煙草中應(yīng)用。本發(fā)明中，我們選擇能夠侵染煙草的大豆花葉病毒株系(SC7)構(gòu)建侵染性克隆載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并注射煙草后，成功的在煙草上形成了系統(tǒng)侵染。這將為煙草在大豆花葉病毒研究方面的應(yīng)用奠定堅實可靠的基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

大豆花葉病毒(SMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，基因組為一條大小約9.6kb的正義RNA鏈，包含5’和3’非編碼區(qū)以及中間的編碼序列。其編碼序列翻譯而成的一條多肽能夠通過自我剪切形成10個成熟的病毒蛋白。大豆花葉病毒寄主較窄，但流行范圍很廣，在全世界的大豆主產(chǎn)區(qū)都有不同程度的發(fā)生。大豆感染大豆花葉病毒后，會產(chǎn)生花葉、葉片皺縮、頂端枯死等癥狀，致使植株生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

研究大豆花葉病毒的致病原因，弄清植物抗大豆花葉病毒的機理，能夠使我們更有效的運用分子育種手段實現(xiàn)良好抗病品種的培育。在以前關(guān)于大豆花葉病毒和抗大豆花葉病毒基因的研究上，我們一直局限于在大豆植株本身上進(jìn)行。但是，由于大豆遺傳轉(zhuǎn)化困難等原因，相關(guān)研究進(jìn)展并不順利；并且，由于大豆花葉病毒的侵染范圍有限，我們尋找抗病基因的范圍始終沒有突破物種界限。植物病毒侵染性克隆載體能夠為病毒與植物的互作等領(lǐng)域提供新的思路。病毒的RNA基因組本身難以進(jìn)行體外的基因操作，構(gòu)建成為以DNA為基礎(chǔ)的侵染性克隆之后，我們很容易進(jìn)行病毒的重組、突變、片段插入缺失等操作，我們還可以使其攜帶外源基因隨病毒的侵染共同表達(dá)。

煙草是進(jìn)行植物抗病研究中常用的模式植物。由于少有大豆花葉病毒株系能夠侵染煙草，所以在大豆花葉病毒的研究上，鮮有對煙草的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體。

本發(fā)明的另一目的是提供轉(zhuǎn)化該載體的農(nóng)桿菌。

本發(fā)明的又一目的是提供該載體和農(nóng)桿菌的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV(SC7)，全序列如SEQIDNO.1所示，構(gòu)建方法如圖1所示，載體圖譜如圖2所示。

本發(fā)明所述的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV(SC7)的構(gòu)建方法，從感染SMV(SC7)的大豆葉片中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，利用多對引物分段擴增獲得SMV的片段，然后利用PCR的方法在其3’UTR之后引入PolyA及HDVrz的序列，且各片段之間存在重疊序列；將上述各個片段及利用SmaI和StuI線性化之后的pCB301載體一起轉(zhuǎn)入酵母W303菌株之中進(jìn)行重組反應(yīng)；篩選重組成功的載體提取質(zhì)粒即形成侵染性克隆載體pCB301-SMV(SC7)。

作為本發(fā)明所述的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選，通過PCR分五段分別擴增獲得SMV的片段：模板為反轉(zhuǎn)錄所得SMV(SC7)的cDNA，擴增frag1a使用引物1c-F-1和1a-2R，擴增frag2a使用引物2a-F和2a-2R，擴增frag3a使用引物3a-F和3a-R，擴增frag4a使用引物4a-F和4a-R，擴增frag5-1a使用引物5a-F和5a-R-1；其中1c-F-1的序列如SEQ ID NO.2所示，1a-2R的序列如SEQ ID NO.3所示，2a-F的序列如SEQ ID NO.5所示，2a-2R的序列如SEQ ID NO.4所示，3a-F的序列如SEQ ID NO.6所示，3a-R的序列如SEQ ID NO.7所示，4a-F的序列如SEQ IDNO.8所示，4a-R的序列如SEQ ID NO.9所示，5a-F的序列如SEQ ID NO.10所示，5a-R-1的序列如SEQ ID NO.11所示。