[發(fā)明專利]可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體和農桿菌菌株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010095003.3
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111440818B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設計）人: 智海劍;殷金龍;王麗群;劉慧;晉彤彤;李凱
• 申請（專利權）人: 南京農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/40;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/82;C12R1/01
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV，其特征在于序列如SEQ IDNO.1所示。

2.權利要求1所述的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV的構建方法，其特征在于從感染大豆花葉病毒SC7的大豆葉片中提取RNA，反轉錄成為cDNA，利用多對引物分段擴增獲得大豆花葉病毒SC7的片段，然后利用PCR的方法在最后一個片段的3’UTR之后引入PolyA及HDVrz的序列，且各片段之間存在重疊序列；將上述各個片段及利用SmaI和StuI線性化之后的pCB301載體一起轉入酵母W303菌株之中進行重組反應；篩選重組成功的載體提取質粒即形成侵染性克隆載體pCB301-SMV。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于通過第一輪PCR分五段分別擴增獲得SMV的片段：模板為反轉錄所得SMV(SC7)的cDNA，擴增frag1a使用引物1c-F-1和1a-2R，擴增frag2a使用引物2a-F和2a-2R，擴增frag3a使用引物3a-F和3a-R，擴增frag4a使用引物4a-F和4a-R，擴增frag5-1a使用引物5a-F和5a-R-1；其中1c-F-1的序列如SEQ ID NO.2所示，1a-2R的序列如SEQ ID NO.3所示，2a-F的序列如SEQ ID NO.5所示，2a-2R的序列如SEQ IDNO.4所示，3a-F的序列如SEQ ID NO.6所示，3a-R的序列如SEQ ID NO.7所示，4a-F的序列如SEQ ID NO.8所示，4a-R的序列如SEQ ID NO.9所示，5a-F的序列如SEQ ID NO.10所示， 5a-R-1的序列如SEQ ID NO.11所示。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于通過另外2輪PCR獲得含PolyA及HDVrz的片段：首先，以上述PCR所得frag5a-1片段為模板，使用引物5a-F和5a-R-2擴增得到frag5a-2片段；然后以上述PCR所得frag5a-2片段為模板，使用引物5a-F和5a-R-3擴增得到frag5a-3片段即為含PolyA及HDVrz的片段；其中5a-F的序列如SEQ ID NO.10所示， 5a-R-2的序列如SEQ ID NO.12所示，5a-R-3的序列如SEQ ID NO.13所示。

5.根據權利要求2~4中任一項所述的構建方法，其特征在于載體pCB301使用NEB內切酶SmaI和StuI進行雙酶切得線性化的pCB301載體；將純化備用的frag1a、frag2a、frag3a、frag4a、frag5a-3以及線性化的pCB301載體按照mol量1:1:1:1:1:1混合均勻，并使用PEG/LiAc介導法轉入酵母W303感受態(tài)細胞，復蘇后涂SD/-Trp平板，放入30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3天，挑取若干單菌落于液體SD/-Trp培養(yǎng)基中，搖菌過夜后進行酵母質粒的提取，該提取的質粒即為pCB301-SMV侵染性克隆載體。

6.轉化了權利要求1所述的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV的農桿菌。

7.權利要求1所述的大豆花葉病毒侵染性克隆載體pCB301-SMV在侵染煙草中的應用。

8.權利要求6所述的農桿菌在侵染煙草中的應用。