[發明專利]一種利用重組海藻糖合成酶合成海藻糖的方法

在審

• 申請號: 202010093045.3
• 申請日: 2020-02-14
• 公開（公告）號: CN111172089A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 饒志明;吳傲;張顯;楊套偉;徐美娟;邵明龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/90;C12N15/77;C12P19/24;C12P19/12;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種利用重組海藻糖合成酶合成海藻糖的方法，屬于生物工程技術領域。本發明首次利用pXMJ19和pDXW?10等載體將海藻糖合成酶在谷氨酸棒桿菌中進行表達，得到一種重組谷氨酸棒桿菌，以此為工程菌種，進行發酵培養，再用高壓勻漿破碎細胞的方法獲得大量的海藻糖合成酶酶液，同時并將其應用于海藻糖的制備。本發明的優點主要是利用食品安全的表達系統來進行海藻糖合成酶的生產和海藻糖的合成，表達的海藻糖合成酶沒有抗菌活性、內毒素等安全隱患，可以滿足食品應用級酶制劑的要求，進一步促進了海藻糖的制備，麥芽糖轉化率達40％，擴展了海藻糖的應用范圍。

技術領域

本發明涉及一種利用重組海藻糖合成酶合成海藻糖的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

海藻糖(Trehalose)是由兩個葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成天然非還原性二糖，廣泛存在于細菌、真菌、酵母、低等蕨類植物、藻類、昆蟲以及無脊椎動物中。

海藻糖對酸和熱具有高度穩定性，可防止淀粉老化、蛋白質變性和抑制脂肪酸敗，具有矯味矯臭的功能和低吸濕性、低甜度等特性，也被應用于疫苗、酶、活體組織和細胞等的重要活性保護劑。另外，據報道，海藻糖對骨質疏松癥、亨廷頓舞蹈癥、干眼癥等也具有一定程度的輔助治療作用，所以海藻糖在食品加工業、醫藥和生化制品業、農業和化妝品等行業都有著廣泛的應用，具有巨大的市場需求和廣闊的市場前景。可以說，海藻糖已成為世界上最重要的低聚糖資源之一。

目前已知海藻糖合成酶可以利用麥芽糖為底物一步反應生產海藻糖，途徑簡單方便，產率較高，適用于工業化大規模的生產，具有較強的競爭優勢。據研究海藻糖合成酶途徑存在于眾多不同的微生物中，而且已經有不少直接從原始菌落中進行提取或者利用大腸桿菌進行異源表達的報道。但是原始菌落中提取得到的海藻糖合成酶一般存在濃度和酶活較低的問題，而現有通過微生物法構建基因工程菌來發酵生產海藻糖合成酶的方法中，利用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤酵母異源表達海藻糖合成酶也均出現過相關報道，但都存在某些不足。如在大腸桿菌中海藻糖合成酶表達量高，但易形成包涵體，且存在著內毒素等缺陷問題，限制了海藻糖的安全性應用及制備；目前據報道構建產海藻糖合成酶的重組枯草芽孢桿菌海藻糖合成酶，以5升發酵罐發酵制備海藻糖合成酶，產量最高可達175.89±6.83mg/L。如廣西大學黃日波教授團隊以整合型枯草芽孢桿菌25℃下轉化30g/L麥芽糖合成海藻糖的轉化率可達65％，但海藻糖產量較低。北京化工大學張靖坤等在畢赤酵母中進行異源表達且經過基因拷貝數篩選等改進后，可得海藻糖合成酶酶活最高約5000U，但酵母為真核生物，發酵周期較長，進一步應用于工業化穩定生產海藻糖合成酶及海藻糖仍然需要更多的研究。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)現在主要被應用于氨基酸和其他小分子化合物等的生產，有著無內毒素、蛋白分泌能力強、胞外無水解酶活性等優點，是一種極具應用潛力和開發價值的安全性蛋白表達宿主。隨著對生物醫藥重組蛋白生產安全性的重視程度越來越高，已經有利用整合型重組枯草芽孢桿菌中進行海藻糖合成酶的生產和制備海藻糖的研究，但尚還沒有在谷氨酸棒桿菌中進行海藻糖合成酶的表達和生產的報道。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種重組谷氨酸棒桿菌，是以谷氨酸棒桿菌為宿主，表達編碼海藻糖合成酶的基因，所述海藻糖合成酶的來源包括天藍色鏈霉菌、谷氨酸棒桿菌或水棲嗜熱菌。

在本發明的一種實施方式，所述海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10中的任一所示。

在本發明的一種實施方式，所述海藻糖合成酶來源于天藍色鏈霉菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發明的一種實施方式，所述海藻糖合成酶來源于谷氨酸棒桿菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。