[發(fā)明專利]一種用于新冠病毒核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010091557.6
• 申請(qǐng)日: 2020-02-13
• 公開（公告）號(hào): CN111187856B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鑫杰;張玉;黃行許
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦

1.一種用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒，其特征在于，包括適用于新冠病毒SARS-CoV-2快速檢測(cè)的Cpf1熒光檢測(cè)體系；所述Cpf1熒光檢測(cè)體系包括：針對(duì)新冠病毒SARS-CoV-2基因orf1a檢測(cè)區(qū)段的特異性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA報(bào)告系統(tǒng)；

所述針對(duì)新冠病毒SARS-CoV-2基因orf1a檢測(cè)區(qū)段的特異性crRNA為針對(duì)orf1a基因的orf1a-crRNA1到orf1a-crRNA2，其序列為SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 2；

所述ssDNA報(bào)告系統(tǒng)包括用于酶標(biāo)儀熒光檢測(cè)或熒光燈下肉眼直接判讀的ssDNA FQreporter ，所述ssDNA FQ reporter為利用6-羧基熒光素和熒光淬滅劑標(biāo)記的ssDNA，標(biāo)記產(chǎn)物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名為ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。

2.如權(quán)利要求1所述的用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒，其特征在于，所述Cpf1熒光檢測(cè)體系還包括針對(duì)新冠病毒SARS-CoV-2基因orf1b、N、和/或、E檢測(cè)區(qū)段的特異性crRNA，所述針對(duì)新冠病毒SARS-CoV-2基因orf1b、N、和/或、E檢測(cè)區(qū)段的特異性crRNA為針對(duì)orf1b基因的orf1b-crRNA1到orf1b-crRNA3、針對(duì)N基因的N-crRNA1到N-crRNA2、和/或、針對(duì)E基因的E-crRNA1到E-crRNA2；其序列為SEQ ID NO: 3到SEQ ID NO:9。

3.如權(quán)利要求1或2所述用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒，其特征在于，所述特異性crRNA為：等比例混合的orf1a-crRNA1和orf1a-crRNA2，命名為orf1a-crRNAmix；或等比例混合的orf1b-crRNA1、orf1b-crRNA2和orf1b-crRNA3，命名為orf1b-crRNAmix；或等比例混合的N-crRNA1和N-crRNA2，命名為N-crRNAmix；或等比例混合的E-crRNA1和E-crRNA2，命名為E-crRNAmix。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒的制備方法，其特征在于，所述特異性crRNA的制備方法包括：針對(duì)SARS-CoV-2病毒核酸orf1a基因，其序列為SEQ ID NO: 10，尋找包含cpf1識(shí)別序列TTTN的靶向序列，設(shè)計(jì)23bp長度的crRNA；設(shè)計(jì)完成后，制備crRNA；其中，所述crRNA為針對(duì)orf1a基因的orf1a-crRNA1到orf1a-crRNA2，其序列為SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 2；

所述Cpf1蛋白的制備方法包括：針對(duì)cpf1蛋白核酸序列進(jìn)行原核密碼子優(yōu)化獲得序列SEQ ID NO: 14，構(gòu)建到pET28a表達(dá)載體，進(jìn)行低溫誘導(dǎo)可溶蛋白表達(dá)，通過親和純化和分子篩純化獲得目的蛋白。

5.如權(quán)利要求4所述用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒的制備方法，其特征在于，所述特異性crRNA的制備方法還包括針對(duì)SARS-CoV-2病毒核酸orf1b、N、和/或、E基因，其序列為SEQ ID NO: 11到SEQ ID NO: 13，尋找包含cpf1識(shí)別序列TTTN的靶向序列，設(shè)計(jì)23bp長度的crRNA，所述針對(duì)SARS-CoV-2病毒核酸orf1b、N、和/或、E基因設(shè)計(jì)的crRNA為針對(duì)orf1b基因的orf1b-crRNA1到orf1b-crRNA3、針對(duì)N基因的N-crRNA1到N-crRNA2、和/或、針對(duì)E基因的E-crRNA1到E-crRNA2；其序列為SEQ ID NO: 3到SEQ ID NO:9。

6.如權(quán)利要求4或5所述用于新冠病毒SARS-CoV-2核酸快速檢測(cè)的Cpf1試劑盒的制備方法，其特征在于，所述crRNA的制備包括構(gòu)建載體pUC57-T7-crRNA，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得目的crRNA；或直接合成crRNA序列對(duì)應(yīng)的RNA。