[發明專利]快速檢測杭白菊中三種真菌的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010087155.9
• 申請日: 2020-02-11
• 公開（公告）號: CN111206112B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 宋陽;申屠旭萍;曹瑱艷;俞曉平;許益鵬;劉光富
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明公開了一種快速檢測杭白菊中三種真菌的引物組、試劑盒及方法，針對病原菌在杭白菊不同的發育時期和環境條件下所表現的癥狀可能一樣的問題以及現有檢測方法耗時久的問題。本發明利用巢氏多重PCR建立了一種對杭白菊上三種主要病原菌的多目標快速檢測的引物組和方法，整個檢測流程只需要5～6個小時，方法的檢出限可以達到1ng/μL，且檢出率可達90％以上。該方法能更快、更準確地檢測病原體，甚至可以在杭白菊未出現病害表征時檢測到相應的病原菌。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種快速檢測杭白菊中三種主要真菌引物組、試劑盒及方法。

背景技術

杭白菊(Chrysanthemum?morifolium?Ramat)又稱小湯黃、甘菊、茶菊，菊科菊屬多年生草本植物，是我國傳統的藥用栽培植物和浙江省八大藥材“浙八味”之一，主產地為浙江省桐鄉市。2010年版《中國藥典》將杭白菊、貢菊、滁菊、亳菊列為中國的“四大”馳名藥用菊花，作為衛生部首批批準的藥食同源的道地藥材之一。杭白菊以干燥頭狀花序入藥，主要成分為黃酮類、綠原酸、糖類、揮發油等?，F代藥理學研究表明，杭白菊具有舒血管、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、驅鉛等多種藥理作用。目前浙江杭白菊常年種植面積約7萬畝，干花總產量達到5000-7000噸，年均總產值超過5億元，占全國菊花總銷量的近90％。隨著杭白菊知名度的提高，其種植規模也在不斷的擴增，但由于種植技術的不規范加上農藥的亂用濫用，使得植株抗病性減弱、病原累積嚴重、病蟲害大量爆發，農藥的濫用亂用，嚴重影響了杭白菊的產量與質量。因此，及早診斷，及早防治杭白菊病害是提高杭白菊產量與質量至關重要一環。

經田間調查發現葉枯病、枯萎病、黑斑病是杭白菊病害中三種發生頻率較高的真菌病害，引起這三種病害的病原菌分別是球毛殼菌Chaetomium?globosum，半裸鐮刀菌Fusarium?inarnatum和互隔交鏈孢菌Alternaria?alternata。這些病原菌長期存活于土壤，遇到適宜的氣候條件時，便會造成病害的大量爆發。此外這些病害常?；旌习l生，存在多種病原菌復合侵染的現象，且不同的病原菌在杭白菊不同的發育時期，不同的環境條件下所表現的癥狀可能一樣，僅靠人為的肉眼鑒定存在一定的困難與誤差。因此，建立快速檢測技術對杭白菊病害的防治具有重要的指導意義。隨著分子生物學的發展，免疫技術和PCR技術不斷引入該領域，但植物病害的病原體種類繁多，血清類型多，漏檢問題難以避免，而且血清反應的特異性較差，從而使得免疫技術在大范圍的實際應用中受到制約。PCR及其相關衍生技術以其快速、靈敏和準確等優點已廣泛應用于植物病害的檢測研究。巢氏PCR即兩步PCR，它使用了兩對PCR引物進行擴增：一對普通引物一對巢式引物，以第一輪普通引物擴增出的產物作為第二輪PCR的模板，巢式引物也是根據第一輪普通引物擴增出的片段所設計的特異性引物，因此巢氏PCR顯著的提高了反應的靈敏度及特異性。多重PCR是指在同一反應體系中加入兩對或兩對以上引物，當體系中存在與各引物對特異互補的模板時,就會出現相應的條帶。因此當巢氏PCR與多重PCR結合應用于植物病原菌的快速檢測時，不僅可以提高檢測的靈敏度還可以實現多種病原菌的多目標快速檢測。

傳統的植物病害的診斷大多依靠平板分離法，先分離出病原真菌，再對病原真菌進行鑒定，這不僅需要先進的分類學知識，而且需要時間和成本，整個過程可能需要15～20天。但在疾病的早期發現和診斷對于農民預防疾病暴發和選擇準確的控制策略至關重要。因此，有必要建立一種準確、快速、經濟的檢測方法，用于田間植物病原菌的早期診斷。利用巢氏多重PCR所建立的杭白菊上三種病原真菌的快速檢測體系整個流程只需要5～6個小時，并且具有高特異性、高靈敏度等優點。

發明內容

本發明利用巢氏多重PCR建立了一種對杭白菊上三種主要病原菌的多目標快速檢測體系，并對該體系進行了優化，使的該體系的檢出限可以達到1ng/μL。并在實際應用中發現與傳統平板分離法相比，該體系能更快、更準確地檢測病原體，且檢出率可達90％以上。