[發明專利]快速檢測杭白菊中三種真菌的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010087155.9
• 申請日: 2020-02-11
• 公開（公告）號: CN111206112B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 宋陽;申屠旭萍;曹瑱艷;俞曉平;許益鵬;劉光富
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

1.一種快速檢測杭白菊中三種真菌的方法，所述三種真菌分別為球毛殼菌Chaetomiumglobosum、半裸鐮刀菌Fusarium?inarnatum和互隔交鏈孢菌Alternaria?alternata；其特征在于包括如下步驟：

1)帶病植株DNA的提?。?/p>

取帶病植物組織，于液氮中冷凍后打碎成粉末，提取其DNA；

2)巢氏多重PCR的擴增：

第一輪PCR使用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增帶病植株中病原真菌的ITS序列，其中ITS1序列如SEQ?ID?No.7所示，ITS4序列如SEQ?ID?No.8所示；步驟2)中第一輪PCR擴增體系及條件具體為：PCR反應為25μL體系，包括含Mg²⁺10×buffer?2μL，10mol/L?dNTP?0.5μL，10μM/L引物ITS1/ITS4?3μL，2U/μL?Taq?polymerase?0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O?18.1μL；擴增條件為：94℃預變性2min，94℃變性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環；最終72℃延伸10min；

第二輪PCR使用第一輪PCR的產物作為模板，采用的引物組包括三對特異性引物對，每對特異性引物對的具體引物序列如下：

特異性引物對一：

正向引物QM5-F：CGTTACCTATACCGTTGC；

反向引物QM5-R：AGAGCGAGATGTATGCTACT；

特異性引物對二：

正向引物HG1-F：GAGGACCCTAAACTCTGTT；

反向引物HG1-R：ATGATTACTACGCTATGGAA；

特異性引物對三：

正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT；

反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA；

第二輪PCR擴增體系及條件具體為：PCR反應為25μL體系，包括含Mg²⁺的10×buffer?2μL，10mol/L?dNTP?0.5μL，10μM/L引物QM5-F/QM5-R?0.6μL、HG1-F/HG1-R?1μL、Al-F/Al-R1.6μL、2U/μL?Taq?polymerase?0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O?17.9μL；擴增條件為：94℃預變性2min，94℃變性45s，55-58℃退火30s，72℃延伸45s，共20個循環；最終72℃延伸8min；

3)擴增結果的檢測：

根據步驟2)擴增出的條帶片段大小判斷其對應的病原真菌；其中球毛殼菌C.globosum目的片段大小為409bp；半裸鐮刀菌F.inarnatum目的片段大小為311bp；互隔交鏈孢菌A.alternate目的片段大小為249bp。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中的DNA提取方法具體為：

a)在打成粉末的植物組織中加入500μL的CTAB溶液，于液氮內冷凍2min，再放于75℃水浴鍋內融化2min，重復1-3次，其中最后1次于75℃水浴鍋內融化時間為30min；

b)接著加入500μL的DNA提取液混勻，12000r/min離心10min，取上清液400μL，所述DNA提取液由苯酚∶氯仿∶異戊醇按體積比25∶24∶1組成；

c)再重復步驟b)一次后加入800μL冰無水乙醇及5M的氯化鈉溶液200μL沉淀1h，12000r/min離心10min，棄上清液，沉淀用70％乙醇洗滌，自然風干后用50μL?ddH2O溶解DNA，-20℃保存備用；提取的DNA用分光光度計測量OD值，使OD_260/280控制在1.8-2.0之間，用作后續PCR模板。