[發明專利]快速檢測浙貝母中兩種真菌的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010087044.8
• 申請日: 2020-02-11
• 公開（公告）號: CN111206111B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 申屠旭萍;曹瑱艷;宋陽;俞曉平;許益鵬;劉光富;張蓬軍
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明公開了一種快速檢測浙貝母中兩種真菌的引物組、試劑盒及方法，針對病原菌在浙貝母不同的發育時期和環境條件下所表現的癥狀可能一樣的問題以及現有檢測方法耗時久的問題。本發明利用巢氏多重PCR建立了一種對浙貝母上兩種主要病原菌的多目標快速檢測的引物組和方法，方法的檢出限可以達到100pg/μL，且檢出率幾乎可達100％。該方法可以提高檢測的靈敏度還可以實現多種病原菌的多目標快速檢測。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種快速檢測浙貝母中兩種真菌引物組、試劑盒及方法。

背景技術

麥浙貝母(Fritillaria?thunbergii)，多年生草本。鱗莖半球形，貝母系百合科貝母種屬多年生草本植物。作為“浙八味”的中藥之一，浙貝母具有極高的藥用應用價值，其鱗莖部位具有止咳化痰、清熱解毒、開郁散結之功效。浙江省寧波市鄞州章水鎮是浙貝母的主產地，目前全省浙貝母播種面積高達5萬畝，產值占全國總量的90％。隨著中藥日益受到大家的認可，加上浙貝母產品質優，使的其在國內外市場上均享有極高的聲譽，成為浙江省主要出口與重點發展的藥材品種之一。伴隨著市場的擴大，浙貝母的種植規模也在不斷的擴增，但由于種植技術的不規范加上農藥的亂用濫用，使得植株抗病性減弱、病原累積嚴重、病蟲害大量爆發，農藥的濫用亂用，嚴重影響了浙貝母的產量與質量。因此，及早診斷，及早防治浙貝母病害是提高浙貝母產量與質量至關重要一環。

經田間調查發現炭疽病和干腐病是浙貝母病害中兩種發生頻率最高的真菌病害，引起這兩種病害的病原菌分別是細線炭疽菌Colletotorichum?lineola和尖孢鐮刀菌Fusarium?oxysporum。這些病原菌長期存活于土壤，遇到適宜的氣候條件時，便會造成病害的大量爆發。此外這些病害常常混合發生，存在多種病原菌復合侵染的現象，且不同的病原菌在浙貝母不同的發育時期，不同的環境條件下所表現的癥狀可能一樣，僅靠人為的肉眼鑒定存在一定的困難與誤差。因此，建立快速檢測技術對浙貝母病害的防治具有重要的指導意義。隨著分子生物學的發展，免疫技術和PCR技術不斷引入該領域，但植物病害的病原體種類繁多，血清類型多，漏檢問題難以避免，而且血清反應的特異性較差，從而使得免疫技術在大范圍的實際應用中受到制約。PCR及其相關衍生技術以其快速、靈敏和準確等優點已廣泛應用于植物病害的檢測研究。巢氏PCR即兩步PCR，它使用了兩對PCR引物進行擴增：一對普通引物一對巢式引物，以第一輪普通引物擴增出的產物作為第二輪PCR的模板，巢式引物也是根據第一輪普通引物擴增出的片段所設計的特異性引物，因此巢氏PCR顯著的提高了反應的靈敏度及特異性。多重PCR是指在同一反應體系中加入兩對或兩對以上引物，當體系中存在與各引物對特異互補的模板時,就會出現相應的條帶。因此當巢氏PCR與多重PCR結合應用于植物病原菌的快速檢測時，不僅可以提高檢測的靈敏度還可以實現多種病原菌的多目標快速檢測。

傳統的植物病害的診斷大多依靠平板分離法，先分離出病原真菌，再對病原真菌進行鑒定，這不僅需要先進的分類學知識，而且需要時間和成本，整個過程可能需要15～20天。但在疾病的早期發現和診斷對于農民預防疾病暴發和選擇準確的控制策略至關重要。因此，有必要建立一種準確、快速、經濟的檢測方法，用于田間植物病原菌的早期診斷。利用巢氏多重PCR所建立的浙貝母上兩種病原真菌的快速檢測體系整個流程只需要5～6個小時，并且具有高特異性、高靈敏度等優點。

發明內容

本發明利用巢氏多重PCR建立了一種對浙貝母上兩種主要病原菌的多目標快速檢測體系，并對該體系進行了優化，使得該體系的檢出限可以達到100pg/μL。并在實際應用中發現與傳統平板分離法相比，該體系能更快、更準確地檢測病原體，且檢出率幾乎可達100％。

本發明的目的是為浙貝母主要真菌病害的早期診斷提供一項新技術。本發明的另一目的是提供該快速檢測方法在浙貝母病害早期診斷上的應用，從而早期防治浙貝母病害，減少浙貝母產量損失，保證浙貝母的高品質。

本發明兩種病原真菌特異性引物的設計與篩選：