[發(fā)明專利]快速檢測(cè)浙貝母中兩種真菌的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010087044.8
• 申請(qǐng)日: 2020-02-11
• 公開（公告）號(hào): CN111206111B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 申屠旭萍;曹瑱艷;宋陽;俞曉平;許益鵬;劉光富;張蓬軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國計(jì)量大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

1.一種快速檢測(cè)浙貝母中兩種真菌的方法，所述兩種真菌分別為細(xì)線炭疽菌Colletotorichum?lineola和尖孢鐮刀菌Fusarium?oxysporum；其特征在于包括如下步驟：

1)帶病植株DNA的提取：

取帶病植物組織，于液氮中冷凍后打碎成粉末，提取其DNA；

2)巢氏多重PCR的擴(kuò)增：

第一輪PCR使用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增帶病植株中病原真菌的ITS序列，其中ITS1序列如SEQ?ID?No.5所示，ITS4序列如SEQ?ID?No.6所示；第一輪PCR擴(kuò)增體系及條件具體為：PCR反應(yīng)為25μL體系，包括含Mg²⁺的10×buffer2μL，10mol/L?dNTP?0.5μL，10μM/L引物ITS1/ITS4?3μL，2U/μL?Taq?polymerase?0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O?18.1μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，55-58℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10min；

第二輪PCR使用第一輪PCR的產(chǎn)物作為模板，采用的引物組包括兩對(duì)特異性引物對(duì)，每對(duì)特異性引物對(duì)的具體引物序列如下：

特異性引物對(duì)一：

正向引物BMTJ4-F：CTACACCCTTTGTGACATACC；

反向引物BMTJ4-R：CGAGACGTTAGTTACTACGC；

特異性引物對(duì)二：

正向引物FO1-F：AACCCCTGTGAACATACCACTTG；

反向引物FO1-R：GAGGAACGCGAATTAACGCGAC；

第二輪PCR擴(kuò)增體系及條件具體為：PCR反應(yīng)為25μL體系，包括含Mg²⁺的10×buffer?2μL，10mol/L?dNTP?0.5μL，10μM/L引物BMTJ4-F/BMTJ4-R?0.6μL、FO1-F/FO1-R?1μL、2U/μLTaq?polymerase?0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O?19.5μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，55-58℃退火30s，72℃延伸45s，共20個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸8min；

3)擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)：

根據(jù)步驟2)擴(kuò)增出的條帶片段大小判斷其對(duì)應(yīng)的病原真菌；其中細(xì)線炭疽菌C.lineola目的片段大小為421bp；尖孢鐮刀菌F.oxysporum目的片段大小為341bp。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中的DNA提取方法具體為：

a)在打成粉末的植物組織中加入500μL的CTAB溶液，于液氮內(nèi)冷凍2min，再放于75℃水浴鍋內(nèi)融化2min，重復(fù)1-3次，其中最后1次于75℃水浴鍋內(nèi)融化時(shí)間為30min；

b)接著加入500μL的DNA提取液混勻，12000r/min離心10min，取上清液400μL，所述DNA提取液由苯酚∶氯仿∶異戊醇按體積比25∶24∶1組成；

c)再重復(fù)步驟b)一次后加入800μL冰無水乙醇及5M的氯化鈉溶液200μL沉淀1h，12000r/min離心10min，棄上清液，沉淀用70％乙醇洗滌，自然風(fēng)干后用50μL?ddH2O溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫惶崛〉腄NA用分光光度計(jì)測(cè)量OD值，使OD_260/280控制在1.8-2.0之間，用作后續(xù)PCR模板。