[發(fā)明專利]一種提高鏈霉菌雷帕霉素產(chǎn)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010084526.8
• 申請(qǐng)日: 2020-02-10
• 公開（公告）號(hào): CN113249401B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜衛(wèi)紅;田進(jìn)忠;孫新強(qiáng);蘆銀華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號(hào): C12N15/76
• 分類號(hào): C12N15/76;C12N15/74;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/61;C12N1/21;C12P17/18
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明提供了一種提高鏈霉菌雷帕霉素產(chǎn)量的方法。本發(fā)明揭示了雷帕霉素生產(chǎn)菌中參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸合成或芳香族氨基酸合成途徑的一些目標(biāo)基因與該生產(chǎn)菌的雷帕霉素產(chǎn)量密切相關(guān)，下調(diào)所述目標(biāo)基因，可以極為顯著地提高雷帕霉素生產(chǎn)菌的雷帕霉素產(chǎn)量。同時(shí)，本發(fā)明還優(yōu)化了重組表達(dá)體系以及表達(dá)菌株，設(shè)計(jì)了有效的重組表達(dá)構(gòu)建物、配合雷帕霉素生產(chǎn)菌的群感效應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了兼顧菌株生長(zhǎng)以及雷帕霉素生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)控制。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種提高鏈霉菌雷帕霉素產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

雷帕霉素是一種非常重要的鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物，具有抗真菌、免疫抑制、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和抗衰老等多種生物活性。雷帕霉素作為免疫抑制劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，比鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑-環(huán)孢菌素A作用強(qiáng)10～100倍。不僅可以有效抑制急性器官移植免疫排斥反應(yīng)，還可以有效抑制FK506和環(huán)孢菌素A不能抑制的慢性器官移植免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)避免了環(huán)孢霉素引發(fā)腫瘤的可能性。FDA分別在1999年批準(zhǔn)其用于減輕腎移植免疫排斥反應(yīng)和2003批準(zhǔn)其用于藥物洗脫支架涂料。在抗腫瘤方面FDA分別在2007、2008、2010和2011批準(zhǔn)其用于腎細(xì)胞癌、套細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性硬化癥和胰腺癌的治療。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素還能夠顯著提升酵母、線蟲、果蠅和小鼠的壽命。近的報(bào)道顯示，雷帕霉素在減緩人體皮膚衰老方面也有顯著的效果。因此，雷帕霉素的市場(chǎng)前景非常廣闊。

雷帕霉素的生物發(fā)酵產(chǎn)量極低，通過傳統(tǒng)代謝工程策略改造菌株的效果不佳。究其原因，是因?yàn)椴荒茉谇‘?dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)平衡初級(jí)代謝和次級(jí)代謝，優(yōu)化代謝流的分配。因此，通過動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控來優(yōu)化雷帕鏈霉菌的代謝網(wǎng)絡(luò)，是值得重點(diǎn)考慮的提高雷帕霉素產(chǎn)量的一種潛在有效策略。

現(xiàn)有的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)分為以下幾種類型：(1)基于外源添加誘導(dǎo)劑的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，需要人為的監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、在合適的時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)劑改變基因表達(dá)。(2)途徑依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，通過高度特異性的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件(轉(zhuǎn)錄因子、核糖開關(guān)等)自動(dòng)響應(yīng)宿主細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物。(3)途徑非依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，利用調(diào)控元件如群感效應(yīng)(QS)系統(tǒng)將基因表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)自動(dòng)關(guān)聯(lián)。這些動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)雖然各具特點(diǎn)，但存在的共性問題是通用性差且難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多基因不同表達(dá)強(qiáng)度的控制。因此構(gòu)建一種能夠同時(shí)控制多基因、控制強(qiáng)度可方便更改的、普適性強(qiáng)且容易操作的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，將會(huì)大大加強(qiáng)我們改造微生物的能力，進(jìn)一步提升不同類型目的產(chǎn)物的產(chǎn)量

迄今為止利用動(dòng)態(tài)調(diào)控提高雷帕霉素產(chǎn)量的文章尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種提高鏈霉菌雷帕霉素產(chǎn)量的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)雷帕霉素的方法，所述方法包括：(1)下調(diào)雷帕霉素生產(chǎn)菌中目標(biāo)基因表達(dá)；其中，所述目標(biāo)基因包括選自下組的基因或其組合：三羧酸循環(huán)途徑基因gltA、脂肪酸合成途徑基因fabH，芳香族氨基酸合成途徑基因cm；(2)培養(yǎng)(1)的雷帕霉素生產(chǎn)菌，生產(chǎn)雷帕霉素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述三羧酸循環(huán)途徑基因gltA包括選自下組的基因或其組合：gltA1、gltA2、gltA3；或，所述脂肪酸合成途徑基因fabH包括選自下組的基因或其組合：fabH1、fabH2、fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途徑基因cm包括選自下組的基因或其組合：cm1、cm2、cm3、cm4；較佳地，所述三羧酸循環(huán)途徑基因gltA為gltA2；或，所述脂肪酸合成途徑基因fabH為fabH3；或，所述芳香族氨基酸合成途徑基因cm為cm2。

在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)基因的組合包括：gltA、fabH和cm的組合；更佳地，包括選自下組的組合：fabH3、gltA2和cm2的組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的下調(diào)雷帕霉素生產(chǎn)菌中目標(biāo)基因表達(dá)包括：(a)在雷帕霉素生產(chǎn)菌中敲除或沉默所述目標(biāo)基因；(b)將下調(diào)所述目標(biāo)基因的下調(diào)劑引入雷帕霉素生產(chǎn)菌中；或(c)調(diào)節(jié)(如上調(diào)或下調(diào))雷帕霉素生產(chǎn)菌中所述目標(biāo)基因的上游信號(hào)通路或上游基因，以下調(diào)所述目標(biāo)基因。