[發明專利]一種基于CRISPR-Cas13a系統檢測微生物的方法及應用

有效

• 申請號: 202010083137.3
• 申請日: 2020-02-08
• 公開（公告）號: CN111321234B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 馬龍;滿淑麗
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 蘇州達權專利代理事務所(普通合伙) 32737
• 代理人: 溫明霞

本發明涉及一種基于CRISPR?Cas13a檢測微生物的方法，首先對待測細菌進行前處理，提取其基因組，通過PCR擴增以及體外轉錄兩步得到RNA，稱作target RNA。當target RNA存在時可以激發Cas13a?crRNA復合物的附屬切割能力，即切割無關單鏈RNA。在此RNA一端修飾熒光基團，另一端修飾淬滅基團。當Cas13a?crRNA復合物檢測到相應的Target RNA時，能夠切割熒光探針，導致熒光值增加，熒光值的增長與待測細菌存在線性對應關系，利用此來檢測微生物。本方法具有出色的可靠性、極高的靈敏性、高度的特異性、易于實施和檢測所需時間短的特點，其對微生物的檢測具有巨大潛力。

技術領域

本發明屬于食品安全檢測生物技術領域，尤其是一種基于CRISPR-Cas13a系統靈敏、特異性的檢測金黃色葡萄球菌的方法及應用。

背景技術

進入21世紀以來，食源性疾病已成為影響公眾健康的重要因素，根據世界衛生組織(WHO)統計，全球每年有近15億人感染食源性疾病，其中70％是由食品中致病微生物污染引起的。江南大學食品安全風險治理研究院聯合多家大學發布的《中國食品安全發展報告(2018)》指出，目前我國食品安全還存在四大主要風險，其中微生物污染問題最為嚴重，占抽檢發現的不合格樣品總量的32.74％，較2016年上升了4.84％。食品安全問題備受各級政府、學術界和民間的重視。致病微生物由于個體微小，世代時間非常短，能夠通過形成菌膜等方式逃脫消毒劑和殺菌劑等消殺處理，因此分布很廣。其中由于致病菌引起的污染在食品污染中最為常見，常見的致病菌有沙門氏菌、彎曲菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒梭菌、單核細胞增生李斯特菌以及致病性大腸桿菌等。

為了防止疾病暴發并為消費者提供安全的食物，需要快速靈敏地檢測食品中的致病微生物含量。傳統檢測方法依賴于微生物培養，然后進行生化鑒定和抗菌藥敏試驗。然而，這種方法耗時、周期長，一般要經過前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生化鑒定、血清學鑒定5個步驟，往往需要4到7天，甚至更長時間才能做出最終鑒定。近年來興起的方法，如基因測序、NMR(核磁共振)、MS(質譜)、DNA微陣列、組學方法等需要大型昂貴儀器，實驗周期長，不利于快速現場即時檢驗。此外，基于抗原-抗體反應的免疫學方法也層出不窮，并且部分已經應用到實際，但其也存在成本高，抗體制備周期長，某些劇毒性物質不能夠通過免疫動物的方式制備抗體，交叉反應性帶來的假陽性、抗體的不穩定性等諸多困擾。因此開發能夠平衡快速、靶向、可視化、集成化、高精準度、高特異性、搭建周期短等特點的新型食品安全檢測體系迫在眉睫。

微生物簇規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)和CRISPR相關的(CRISPR-Cas)自適應免疫系統是細菌和古細菌在與噬菌體的生存斗爭中進化出的獲得性免疫系統。最近，CRISPR-Cas系統由于其除了能進行crRNA介導的目標核酸切割之外(cis-cleavage)，還具有目標切割激活的核酸附屬切割活性(又稱trans-cleavage)，因此作為用于核酸靶向的快速、精確和強大的檢測平臺而受到歡迎。Zhang等人將Cas13a的附帶效應與等溫擴增相結合，建立了基于CRISPR的診斷程序，并形成了特異性高靈敏度酶報告基因解鎖(SHERLOCK)平臺，從而以對摩爾的敏感性和單堿基錯配特異性成功檢測出Zika和登革熱病毒的特定菌株。此外，CRISPR-Cas13a還被用于檢測高濃度的禽流感A(H7N9)病毒，埃博拉病毒，愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、microRNA和植物基因等。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術環境壓力脅迫問題的不足之處，提供一種基于CRISPR-Cas13a系統靈敏、特異性的檢測微生物的方法及應用，該方法能夠檢測微生物的基因組DNA(gDNA)濃度，特別是金黃色葡萄球菌。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：