[發(fā)明專利]一種基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010083137.3
• 申請日: 2020-02-08
• 公開（公告）號: CN111321234B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 馬龍;滿淑麗
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 蘇州達權專利代理事務所(普通合伙) 32737
• 代理人: 溫明霞

1.一種基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：所述方法通過兩步擴增即PCR擴增以及將PCR產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)錄擴增得到RNA，稱其為target RNA，即目標RNA，設計crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA復合物檢測target RNA；

具體的步驟為：target RNA存在時能夠激發(fā)Cas13a-crRNA復合物的核酸特異性識別引發(fā)的附屬切割能力，即切割無關單鏈RNA；在此情況下，若選擇合成一條RNA，將其一端修飾熒光基團，另外一端修飾淬滅基團，制備成reporter RNA，即報告RNA，reporter RNA就能被Cas13a酶切，產(chǎn)生增強的熒光信號進行輸出；此熒光信號的變化和待檢測細菌的濃度能夠成線性關系，能夠檢測和定量細菌。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：通過兩步擴增待檢測細菌的DNA來得到target RNA，當Cas13a-crRNA檢測到相應的targetRNA時，即target RNA和crRNA能夠互補配對，就能夠切割熒光探針，使熒光基團FAM脫離猝滅基團BHQ1，造成BHQ1對FAM熒光的猝滅被解除，F(xiàn)AM熒光值增加能夠與微生物濃度成線性關系，能夠特異性地檢測和定量特定細菌；

或者，所述方法檢測限為2CFU/mL；檢測動態(tài)區(qū)間為10⁰到10⁷CFU/mL；檢測所需時間從樣品制備直到得到結果總共需要3-4小時。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：步驟如下：

⑴樣品簡單前處理，裂解微生物細胞，釋放基因組DNA(gDNA)；

⑵PCR擴增，對微生物特異性基因片段進行擴增；

⑶體外轉(zhuǎn)錄，將擴增后的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，即為target RNA；

⑷熒光檢測，即可檢測目的基因組微生物DNA濃度。

4.根據(jù)權利要求3所述的基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：所述步驟⑵中微生物特異性基因片段為金葡菌的nuc基因。

5.根據(jù)權利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列為SEQ NO.1，所述Target RNA的核苷酸序列為SEQ NO.2，PCR引物序列分別為SEQ NO.3和SEQ NO.4，所述reporter RNA核苷酸序列為SEQ NO.5。

6.根據(jù)權利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測微生物的方法，其特征在于：所述微生物為金黃色葡萄球菌。