[發(fā)明專利]一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010082993.7
• 申請(qǐng)日: 2020-02-07
• 公開（公告）號(hào): CN113249281B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙廣;孫慎美;咸漠;劉敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發(fā)明涉及一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。為提高間苯三酚生物合成效率，本發(fā)明提供了一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌,以大腸桿菌為出發(fā)菌株，過表達(dá)突變了兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的乙醇脫氫酶基因adhE(A267T,E568K)(267位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，568位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，聚酮合酶基因phlD。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)以乙醇為碳源，經(jīng)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化形成間苯三酚的生物合成路徑，為乙醇的生物利用以及間苯三酚的微生物合成提供了新的技術(shù)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

間苯三酚及其衍生物是生物系統(tǒng)中廣泛存在的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物與微生物中。間苯三酚作為重要的精細(xì)化學(xué)品之一，其及其衍生產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域具有很高的商業(yè)價(jià)值。間苯三酚廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，其既是合成癌癥治療藥物黃酮類化合物的中間體，自身又可作為一種藥物作用于平滑肌，解除解痙癥狀其優(yōu)點(diǎn)在于不會(huì)產(chǎn)生一系列抗膽堿樣以及其他心血管方面的副作用。同時(shí)還常用產(chǎn)婦陣痛，能顯著緩解產(chǎn)婦的不適感。間苯三酚可增加了過氧化氫酶活性及其蛋白的表達(dá)，具備抗氧化抗炎的效果，能用于水果防腐等方面。此外間苯三酚是化工生產(chǎn)的重要原料，能充作多種物系，如戊二醛溶液、合成橡膠、復(fù)合改性雙元燃料火箭推進(jìn)劑(CMDB)的穩(wěn)定劑；也能用于新型酞類燃料的合成；它也可廣泛用于輪胎增粘劑以及偶氮復(fù)合油墨等原料簡(jiǎn)。間苯三酚也常應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，?；g苯三酚通常具有良好的生物活性，例如2，4-二乙酰基間苯三酚能夠防治多種植物病害，能夠很好地抑制真菌以及線蟲。

上世紀(jì)50年代開始，人們?cè)谔剿鏖g苯三酚合成工藝的進(jìn)程中發(fā)明了幾種有明顯優(yōu)勢(shì)的化學(xué)合成方法，包括三硝基甲苯(TNT)法、異丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。間苯三酚作為一種藥物中間體要求有較高的純度，在化學(xué)合成方法中，因氧化及酸分解過程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，使得最終產(chǎn)品的分離提純比較困難，這些副產(chǎn)物與間苯三酚性質(zhì)相似，加之間苯三酚的易氧化性和較差的熱穩(wěn)定性，因此用簡(jiǎn)單的物理方法很難得到高純度產(chǎn)品。作為一種精細(xì)的化工用品，在工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用與間苯三酚的合成困難形成鮮明對(duì)比，尤其是間苯三酚在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用對(duì)其純度有更高的要求。

鑒于化學(xué)法生產(chǎn)間苯三酚存在安全隱患、污染大、質(zhì)量以及純度低等問題，研究者開始轉(zhuǎn)向用微生物生產(chǎn)間苯三酚。生物合成主要是通過構(gòu)建基因工程大腸桿菌，異源表達(dá)合成間苯三酚的基因，發(fā)酵產(chǎn)生間苯三酚。通過基因工程手段不斷優(yōu)化工程菌株，增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)間苯三酚的抗性作用，同時(shí)還要對(duì)間苯三酚的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高間苯三酚的合成濃度和產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容

為提高間苯三酚生物合成效率，本發(fā)明提供了一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌，所采取的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌，所述重組菌過表達(dá)突變的乙醇脫氫酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌為大腸桿菌。

優(yōu)選地，所述乙醇脫氫酶基因phlD來源于大腸桿菌(Escherichia coli)，Genbank登錄號(hào)為945837；所述突變的乙醇脫氫酶基因adhE其編碼的氨基酸第267位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，記為A267T，第568位由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，記為E568K；所述聚酮合酶基因phlD來源于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，Genbank登錄號(hào)為3480329。

本發(fā)明的另一目的是提供一種上述重組菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

1)克隆獲得乙醇脫氫酶基因adhE，將267位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，568位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，得到突變的乙醇脫氫酶基因adhE；克隆獲得聚酮合酶基因phlD；

2)將步驟1)得到突變的乙醇脫氫酶基因adhE連接到質(zhì)粒載體，獲得重組質(zhì)粒I；

3)將步驟1)所得的聚酮合酶基因phlD連接到質(zhì)粒載體，獲得重組質(zhì)粒II；