[發(fā)明專利]一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010082993.7
• 申請日: 2020-02-07
• 公開（公告）號: CN113249281B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙廣;孫慎美;咸漠;劉敏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種利用乙醇生產(chǎn)間苯三酚的重組菌，其特征在于，所述重組菌過表達突變的乙醇脫氫酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌為大腸桿菌；所述乙醇脫氫酶基因adhE來源于大腸桿菌（Escherichia coli）,Genbank 登錄號為945837；所述突變的乙醇脫氫酶基因adhE其編碼的氨基酸第267位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，記為A267T；第568位由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔洖镋568K；所述聚酮合酶基因phlD來源于熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），Genbank 登錄號為3480329。

2.權(quán)利要求1所述的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

1）克隆獲得乙醇脫氫酶基因adhE，將267位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，568位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔玫酵蛔兊囊掖济摎涿富?Italic>adhE；克隆獲得聚酮合酶基因phlD；

2）將步驟1）得到突變的乙醇脫氫酶基因adhE連接到質(zhì)粒載體，獲得重組質(zhì)粒I；

3）將步驟1）所得的聚酮合酶基因phlD連接到質(zhì)粒載體，獲得重組質(zhì)粒II；

4）將步驟2）所得的重組質(zhì)粒I和步驟3）所得的重組質(zhì)粒II同時導(dǎo)入到宿主細胞，獲得重組菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2）所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pACYCDuet-1。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3）所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pET28a。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）以大腸桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計引物克隆乙醇脫氫酶基因adhE；以熒光假單胞菌基因組為模板，設(shè)計引物克隆聚酮合酶基因phlD；

2）將步驟1）所得的乙醇脫氫酶基因連接到質(zhì)粒pACYCDuet-1，獲得重組質(zhì)粒pACYCDuet-adhE，以重組質(zhì)粒pACYCDuet-adhE作為模板，利用定點突變試劑盒突變adhE兩個關(guān)鍵位點A267T和E568K，獲得帶有突變位點的重組質(zhì)粒記為：pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）；

3）將步驟1）所得的聚酮合酶基因phlD連接到質(zhì)粒載體pET28a，獲得重組質(zhì)粒pET28a-phlD；

4）將步驟2）所得的重組質(zhì)粒pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）和步驟3）所得的重組質(zhì)粒pET28a-phlD同時導(dǎo)入受體細胞E.coli W3110，獲得重組菌ZG-3433。

6.權(quán)利要求1所述重組菌在發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)間苯三酚步驟如下：

1）活化權(quán)利要求1所述的重組菌，獲得活化重組菌；

2）將步驟1）所得的活化重組菌接種到含有卡那霉素和氯霉素的檸檬酸鐵銨液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。