[發明專利]一種以含蛋白多糖復合物皮粉為底物的糖苷酶活力測定和性能評價方法

有效

• 申請號: 202010082876.0
• 申請日: 2020-02-07
• 公開（公告）號: CN111172233B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 彭必雨;羅鳳香;鐘祥;高蒙初;張春曉;龍忠珍
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種以含蛋白多糖復合物的皮粉為底物的糖苷酶活力測定和性能評價方法，其特征在于所述方法包括以下步驟，所用材料按照質量份計；

（1）含蛋白多糖復合物的皮粉底物的制備

取保存的動物皮100份，充分水洗，去肉、脫脂后剖層，取厚0.5-1.5?mm的粒面層，稱重后放入轉鼓或振蕩器中，加入清水100-400份，防腐劑0-0.5份，在15-25?℃下浸泡或間隙轉動3-12?h，再用300-500份水洗滌3次，每次30?min，然后進行去毛，將皮切成小塊，自然干燥或冷凍干燥后用皮革碾磨儀打成皮粉，并過50-150目篩，然后加入100-800份伯瑞坦-羅賓森緩沖液反復洗滌，直到上清液中的總糖含量低于檢測限，將皮粉再次干燥，得到含糖量0.01%-2%的皮粉底物；

（2）糖苷酶活力的測定

準確稱取含蛋白多糖復合物的皮粉底物0.1-5g，加入錐形瓶中，加入皮粉質量10-50倍的伯瑞坦-羅賓森緩沖液，在水浴振蕩器中于30°C下保溫并振蕩5-240?min使皮粉完全潤濕；

將待測糖苷酶的樣品用伯瑞坦-羅賓森緩沖溶液溶解，經過離心去除不溶性雜質，經過超濾和/或柱層析去除分子量低于5000?Da的可溶性雜質，再將酶液稀釋至活力濃度為1-50U/mL，酶液在30°C水浴中預熱5?min，加入1?mL待測酶溶液于上述所準備好的含蛋白多糖復合物的皮粉底物的錐形瓶中，在pH值為3.5-12.5、溫度為5-55°C條件下振蕩反應0.5-4?h后，加入1?mL的1-6?mol/L的硫酸溶液將pH快速調至3.0以下，終止酶反應；空白對照樣是在反應樣的終止操作的同時，加入1mL的1-6?mol/L硫酸溶液和1mL酶溶液，其他操作和酶反應實驗完全相同；

反應終止后立即于轉速5000-12000?rpm，溫度4?℃條件下離心10-20?min，取上清液稀釋，然后按照以下方法測上清液中總糖含量；具體為：取2?mL?經稀釋的樣品，加入1mL?濃度為6%的苯酚溶液，混勻后立即沿試管壁加入5?mL濃硫酸，靜置10?min后混勻，90℃保溫靜置30min后，然后冷卻至室溫，測定490?nm處吸光度值，并以稀釋至不同濃度的葡萄糖標準溶液做出相應的標準曲線，根據標準曲線計算總糖的量；

（3）糖苷酶活力的計算

糖苷酶活力定義：1g固體酶或1mL液體酶，在一定溫度和pH值條件下水解皮粉中蛋白多糖復合物，每分鐘產生1μg總糖，即為1個活力單位，以U/g或U/mL表示；

糖苷酶活力

式中

A₁：根據實驗組OD值計算得到的反應樣液中的總糖含量，μg/mL；

A₂：根據空白組OD值計算得到的空白樣液中的總糖含量，μg/mL；

V：反應體系的總體積mL；

N：酶樣品的稀釋倍數；

所述動物皮包括新鮮的、鹽腌的或冷凍保存的動物皮。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，酶解反應的最優條件為：皮粉底物用量為2g，酶解反應時間為2小時，反應溶液中糖苷酶的活力濃度為5-35?U/mL。

3.如權利要求1或2所述的方法在動物皮加工利用領域中測定各種糖苷酶對動物皮中的蛋白多糖復合物水解活力及性能的用途。