[發明專利]用于鑒定羅布麻綠肖葉甲的核苷酸序列及鑒定方法

有效

• 申請號: 202010082220.9
• 申請日: 2020-02-07
• 公開（公告）號: CN111172291B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 袁明龍;馮潤秋;段廷玉;李春杰
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

本發明提供用于鑒定羅布麻綠肖葉甲的核苷酸序列，所述核苷酸序列為羅布麻綠肖葉甲線粒體CO1基因組序列。本發明還提供相應的羅布麻綠肖葉甲的鑒定方法。本發明方法能對羅布麻綠肖葉甲成蟲以及幼蟲或殘缺個體進行鑒定，具有準確、迅速、便捷和費用低的特點，相比傳統的形態特征鑒定方法，即節省時間又降低費用。本發明方法對使用的儀器設備要求較低，一般的分子生物學實驗室均可進行，比傳統的形態學鑒別更準確可靠。本發明第一次獲得羅布麻綠肖葉甲的CO1序列，從根本上解決了當前羅布麻綠肖葉甲在防治過程中較難進行準確鑒定，幼蟲易與其他鞘翅目幼蟲混淆等難題，填補了行業空白，具有重要意義。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及羅布麻主要害蟲羅布麻綠肖葉甲的鑒定方法。

背景技術

羅布麻屬夾竹桃科(Apocynaceae)多年生宿根性草本植物或半灌木，主要分布在中亞地區，我國主要分布在長江以北的廣大鹽堿沙荒地區。隨著相關科學研究的逐步深入，發現羅布麻具有喜光、抗風蝕、耐貧瘠、鹽堿、干旱、酷暑寒冷等特點，是保持水土、涵養水分、防風固沙的理想荒漠植物之一。羅布麻葉片可用于制茶和制藥，輔助治療與肝臟、腎臟和心腦血管有關的疾病，其韌皮纖維可與棉、麻等混紡，制作高檔紡織面料。由于其兼具生態及經濟雙重功能，正引起社會各界廣泛關注與利用。

羅布麻綠肖葉甲(Chrysochares punctatus)是鞘翅目(Coleoptera)肖葉甲科(Eumolpidae)綠肖葉甲屬(Chrysochares)的一種昆蟲。該蟲主要分布于新疆、甘肅、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦和烏茲別克斯坦等。在新疆阿勒泰地區，其主要寄主為羅布紅麻(Apocynum venetum)、大葉白麻(Poacynum hendersonii)、白麻(Poacynum pictum)，是羅布麻田主要的害蟲之一，該蟲主要以成蟲為害，常10余頭聚集于一株羅布麻頂端啃食羅布麻嫩葉。一般從羅布麻嫩葉的邊緣開始啃食，造成葉片畸形，嚴重時只留下葉脈。一般在6月份開始大量爆發，持續到8月份，年發生1-2代，以幼蟲于土壤、植物根際、植物殘體下面等地方越冬。該蟲的大規模爆發使羅布麻大規模減產，尤其對羅布麻產茶業造成嚴重的經濟損失。

傳統的物種鑒別手段主要依賴于昆蟲形態等特征，存在較大的局限性，不僅費時費力，而且易受主觀因素干擾，極易混淆出錯。其次，新疆阿勒泰地區羅布麻田鞘翅目昆蟲較多，鞘翅目幼蟲多為蠐螬型，由于羅布麻綠肖葉甲的卵、幼蟲和蛹與其他鞘翅目昆蟲相似，生存在地下，危害羅布麻的地下部分，傳統的鑒別方法難以展開針對幼蟲或殘缺個體的鑒別，而使用分子生物學手段可以快速，準確的鑒別處羅布麻綠肖葉甲成蟲及幼蟲。

快速準確的物種鑒定手段是科學防治田間害蟲的重要前提與基礎。現如今有關羅布麻綠肖葉甲的研究幾乎空白，僅《動物志》中記載了其成蟲的形態特征。因此有必要尋找一種快捷、準確鑒別的分子生物學方法，從而應用于檢疫及有效地控制其給田間生產帶來的危害。

自DNA條形碼(DNA barcode)技術問世至今，已受到分子生物學領域的廣泛關注。DNA條形碼是指生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。當存在某種未知物種需要鑒定時，可獲取其DNA條形碼，然后與數據庫中的其他條形碼進行比對，若與某已知物種相匹配，則可成功鑒定未知物種。該技術可以快速準確的對物種進行分類鑒定，彌補了傳統形態學鑒定的很多不足，因此廣泛的用于動植物的分類鑒定。但目前國內外尚無利用DNA條形碼作為分子標記手段進行鑒別羅布麻綠肖葉甲的相關研究及報道。

發明內容

本發明針對現有技術中羅布麻綠肖葉甲的形態鑒定困難的問題，提供了一種快速簡便準確的分子生物學鑒定方法，該方法主要是提取羅布麻綠肖葉甲的總DNA，利用DNA條形碼通用引物擴增其線粒體CO1基因序列作為標記并進行物種鑒別的序列特征比對，從而進行物種鑒定。