[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標(biāo)記基因重組毒株的構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010081916.X
• 申請(qǐng)日: 2020-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN111996213A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋祖樟;王豪;謝欣;任同偉;王玉旭;賀微;陳櫻;歐陽(yáng)康;黃偉堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發(fā)明公開了豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標(biāo)記基因重組毒株的構(gòu)建方法，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒傳代致弱株Gxnn1396?P96作為親本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2區(qū)域465個(gè)核苷酸并在缺失位置插入紅色熒光蛋白基因，在此基礎(chǔ)上，在ORF1b和ORF2a間插入綠色熒光蛋白基因，獲得插入雙熒光蛋白基因標(biāo)記的重組PRRSV病毒。測(cè)序表明重組病毒遺傳穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳至20代內(nèi)未發(fā)現(xiàn)插入的標(biāo)記基因的熒光豐富度降低。綜上，本發(fā)明建立了一套豬繁殖與呼吸綜合征活病毒載體系統(tǒng)，可同時(shí)插入多種外源基因，較一般的活病毒載體系統(tǒng)更加高效，且遺傳穩(wěn)定，為研制重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于豬繁殖與呼吸綜合征病毒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標(biāo)記基因重組毒株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又名“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespirat ory syndrome virus，PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染性疾病，以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙為特征，豬是唯一的感染宿主，自1987年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)PRRSV感染至今，PRRSV已經(jīng)經(jīng)歷了多次爆發(fā)，給世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PRRSV屬套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的成員，基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約15.6kb，含有至少10個(gè)開放閱讀框，5＇端含有帽子結(jié)構(gòu)，3＇端含有PolyA。ORF1a和ORF1b約占據(jù)了基因組3/4，它們編碼病毒復(fù)制酶蛋白pp1a和pp1b。pp1a和pp1b復(fù)制酶蛋白通過自剪切形成了14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a編碼的病毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、2b、GP3、GP4和GP5a，ORF5、ORF6和ORF7編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M和N。

PRRSV反向遺傳系統(tǒng)的快速發(fā)展為PRRSV作為活病毒載體疫苗的研發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。NSP2是PRRSV編碼的所有蛋白中變異最大的,在NSP2高變區(qū)(HVR)經(jīng)常發(fā)生氨基酸的缺失和插入.截止到目前為止，國(guó)內(nèi)外多名學(xué)者都將NSP2的HVR區(qū)域作為外源基因插入的靶點(diǎn)，但是獲得的重組病毒遺傳不穩(wěn)定，大多插入的外源基因在連續(xù)傳代的過程中逐漸丟失。除此之外，還有另外一種策略是通過插入額外的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單元來產(chǎn)生額外的亞基因組mRMA(sg mRNA)來表達(dá)外源基因。由于PRRSV大多數(shù)的開放閱讀框之間都存在交叉重疊，故這種策略所能選擇的靶點(diǎn)有限。到目前為止，ORF1b和ORF2a、ORF7和3’UTR是人們研究較多的外源基因插入位點(diǎn)。該策略在外源基因后插入一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS)，插入的外源基因的sg mRNA由外源基因上游基因組TRS調(diào)控合成，而人工插入的TRS調(diào)控下游病毒結(jié)構(gòu)蛋白的sg mRNA的產(chǎn)生，利用這種策略，國(guó)內(nèi)外學(xué)者拯救出多種重組病毒，且部分重組病毒在連續(xù)傳代的過程中保持穩(wěn)定。

目前為止，以PRRSV表達(dá)外源基因的研究主要為單一位點(diǎn)且部分重組病毒遺傳不穩(wěn)定，暫沒有多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)外源基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標(biāo)記基因重組毒株的構(gòu)建方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙標(biāo)記基因重組毒株的構(gòu)建方法，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒Gxnn1396-P96作為親本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2區(qū)域465個(gè)核苷酸(3049-3513nt)并在缺失位置插入一標(biāo)記基因，在此基礎(chǔ)上，在ORF1b和ORF2a間插入另一標(biāo)記基因，獲得插入雙基因標(biāo)記的重組PRRSV病毒。