[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標記基因重組毒株的構建方法

在審

• 申請號: 202010081916.X
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN111996213A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 韋祖樟;王豪;謝欣;任同偉;王玉旭;賀微;陳櫻;歐陽康;黃偉堅
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙標記基因重組毒株的構建方法，其特征在于：將豬繁殖與呼吸綜合征病毒Gxnn1396-P96作為親本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2區域465個核苷酸并在缺失位置插入一標記基因，在此基礎上，在ORF1b和ORF2a間插入另一標記基因，獲得插入雙基因標記的重組PRRSV病毒。

2.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙熒光標記基因重組毒株的構建方法，其特征在于：將豬繁殖與呼吸綜合征病毒傳代致弱株Gxnn1396-P96Gxnn作為親本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2區域465個核苷酸并在缺失位置插入紅色熒光蛋白基因，在此基礎上，在ORF1b和ORF2a間插入綠色熒光蛋白基因，獲得插入雙熒光蛋白基因標記的重組PRRSV病毒。

3.根據權利要求2所述的的構建方法，其特征在于：所述重組PRRSV病毒為rGX-RFP-GFP。

4.根據權利要求2所述的的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)表達紅色熒光蛋白的PRRSV NSP2缺失突變體pGX-NSP2-RFP的構建

在PRRSV感染性克隆中，采用SOE-PCR方法缺失NSP2高變區第624位氨基酸-778位氨基酸位點區域，同時在缺失區域引入了BstZ17I和SbfI兩個酶切位點，先構建pGXAM的缺失突變體pGX-NSP2-D465，然后，插入紅色熒光蛋白RFP基因，獲得重組質粒pGX-NSP2-RFP。

(2)在PRRSV ORF1b和ORF2a間表達綠色熒光重組克隆pGX-12BS-GFP的構建。

在PRRSV感染性克隆中，利用SOE-PCR方法在ORF1b和ORF2a間引入Bstb I和Sbf I兩個限制性酶切位點，并將SOE-PCR產物克隆到ZeroPCR載體上，獲得穿梭質粒pTOPO-12BS；利用突變PCR將轉錄調控序列TRS克隆到Sbf I酶切位點之后，獲得pTOPO-12BS-TRS，通過將Asc I和Mlu I酶切pTOPO-12BS-TRS獲得的相應片段克隆進入pGXAM，獲得重組克隆pGX-12BS-TRS；在此基礎上，通過人為引入的酶切位點Bstb I和Sbf I將GFP插入pGX-12BS-TRS中，獲得重組質粒pGX-12BS-GFP。

(3)同時表達紅色熒光蛋白基因和綠色熒光蛋白基因的重組質粒pGX-RFP-GFP的構建

使用Asc I和Mlu I兩個限制性酶切位點同時酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收相應酶切產物后，通過T4酶進行連接，獲得重組質粒pGX-RFP-GFP。

5.根據權利要求4所述的的構建方法，其特征在于步驟(1)具體按以下進行操作：以PRRSV的全長感染性克隆pGXAM為模板，使用JX451F和JX6463R擴增，PCR產物克隆到ZeroPCR載體，獲得穿梭質粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2為模板，使用突變引物NSP2 D155BstZ17IF和NSP2 D155 SbfI R以及外側引物GX2350F和GX3921R擴增得到PCR產物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI；以PCR產物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI為模板，使用外側引物GX2350F和GX3921R進行第二輪融合PCR擴增，將PCR產物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI進行融合，將融合PCR產物和pTOPO-P2同時使用Afe I和Bbs I限制性酶切位點進行酶切，T4連接后獲得缺失155aa和引入Bstz 17I和Sbf I限制性酶切位點的克隆pTOPO-P2-D465，使用Spe Ⅰ和Afl II同時酶切pTOPO-P2-D465和pGXAM，進行相應區域的等段替換，獲得pGX-NSP2-D465；在此基礎上，使用引物RFP BstZ17I F和RFP SbfI R擴增紅色熒光蛋白基因，使用BstZ17I和SbfI同時酶切pGX-NSP2-D465和PCR擴增產物，將RFP基因插入到pGX-NSP2-D465中，獲得在NSP2缺失區域插入RFP基因的重組克隆pGX-NSP2-RFP。