[發明專利]一種快速檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081188.2
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN111088404A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 陳翀;劉華勇;謝嬋芳;黃嘉恩
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測手足口病病毒的探針，其特征在于，所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4任一所示，其中SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3的探針用于檢測柯薩奇病毒A16型(CA16)，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4的探針用于檢測腸道病毒71型(EV71)。

2.如權利要求1所述的檢測手足口病病毒的探針，其特征在于， 所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4所示。

3.如權利要求2所述的檢測手足口病病毒的探針，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQID NO .1-2所示的探針，其5’端標記發光基團，3’端標記淬滅基團，第5-10位堿基中任一位置用四氫呋喃殘基（THF）替代。

4.如權利要求2所述的檢測手足口病病毒的探針，其特征在于，所述的SEQ ID NO .3探針5’端起第31位堿基T標記FAM發光基團，第32位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第35位堿基標記BHQ1淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾；所述的SEQ ID NO .4探針5’端起第32位堿基T標記CY5發光基團，第34位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第36位堿基標記BHQ2淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾。

5.一組用于檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的靶標序列、引物對及探針，其特征在于，所述探針為權利要求2-4任一所述的探針，所述引物對核苷酸序列如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6、SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示，所述靶標序列如SEQ ID NO .9、SEQ IDNO .10所示。

6.一種多重檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸提取試劑、恒溫擴增反應模塊、陽性對照和陰性對照，以及權利要求2-4任一所述的探針及權利要求5所述的引物對。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的恒溫擴增反應模塊為RDA或RPA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑；所述RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的重組酶KX。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括重組酶KX 60-600 ng/μL、KY蛋白16-192 ng/μL、單鏈結合蛋白gp32 100-1000ng/μL、鏈置換DNA聚合酶3-100 ng/μL、逆轉錄酶200U、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、Tris緩沖液20~100mM、PEG 2.5%-10%、醋酸鉀或醋酸鈉0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM、DTT 1-12 mM、所述探針150nM-600nM、所述引物對150-600nM。

9.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的核酸提取試劑包括Buffer A、Buffer B；所述Buffer A為樣本裂解液，含有Tris-HCL緩沖體系、NaOH、SDS、EDTA、異硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；所述Buffer B含有Tris緩沖體系、氯化鉀、氯化鎂；所述陽性對照為含有柯薩奇病毒A16型（CA16）、腸道病毒71型（EV71）保守基因的pUC57質粒，所述陰性對照為空載體pUC57質粒。

10.一種非疾病診斷目的檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的檢測方法，其特征在于，包含以下步驟：

提取待測樣品的核酸，以待測樣品的核酸為模板，在柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的引物對、探針及RDA凍干粉試劑、Buffer A和Buffer B存在下進行實時熒光RDA反應，根據實時熒光RDA擴增曲線分析待測樣品；其中所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQID NO .3，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4所示; 其中反應溫度為25-42℃，反應時間大于10分鐘。