[發明專利]一種快速檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081188.2
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN111088404A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 陳翀;劉華勇;謝嬋芳;黃嘉恩
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
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本發明公開一種快速檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的RDA方法及試劑盒，包括特異性引物對以及RDA熒光標記探針，以實現對柯薩奇病毒A16型（CA16）、腸道病毒71型（EV71）進行安全、特異、靈敏、簡便的檢測，從而彌補現有傳統檢測技術的不足。此方法提供的試劑盒可省去核酸提取步驟，并在37～42℃恒溫條件下、20min內實現柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的檢測，特異性為100％，非常適用于現場快速檢測。與普通PCR方法相比，RDA熒光法是在恒溫下反應，不需變溫，不需復雜儀器，而且反應時間短。因此，本發明的方法及其試劑盒具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高、成本低廉等特點，為柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的現場快速檢測篩查提供有效的技術手段，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域。更具體地，涉及一種基于RDA熒光法檢測技術檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型核酸的引物對、探針及相關試劑盒。

背景技術

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，其中以柯薩奇病毒A16型(Coxsachie virus 16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)最為常見。手足口病是一種嬰幼兒常見的傳染病，多發生于5歲以下兒童，表現為發熱，口痛，厭食，手、足和口腔等部位出現小皰疹或小潰瘍，多數患兒一周左右自愈。手足口病病毒可通過直接接觸感染者鼻咽分泌物、唾液、皰疹液或糞便進行傳播。腸道病毒感染，潛伏周期為2～10天，平均3～5天，感染者發病后，一周內傳染性最強，傳染期可持續數周，再加上患者多為嬰幼兒，病情發展快，所以更需要早期、及時發現疾病。

傳統的腸道病毒檢測方法包括病毒分離檢測、血清免疫檢測以及PCR核酸檢測等方法。其中病毒分離檢測方法周期長不適用臨床檢測，血清免疫檢測的方法結果可靠性差，PCR檢測法如常規PCR、RT-PCR、實時熒光定量PCR等，在病原微生物的檢測方向作用重大，但其一般需要能夠進行精密控溫的儀器和實驗室，并且對檢測人員的操作要求較高，不適用于樣品的現場檢測，不利于基層推廣，無法滿足疾病防控簡單、快速、準確的檢測要求。疾病的早期發現和及時診斷，對疾病的診療和預后判斷有重要的臨床意義，因此建立HFMD快速檢測方法尤為重要。

隨著體外核酸恒溫擴增的悄然興起，傳統擴增技術的局限性有所改變，在過去的十年中，使核酸體外擴增變得更加簡單和方便的一些等溫核酸擴增技術已得到快速發展，如LAMP（環介導核酸擴增技術）、HDA（解旋酶依賴等溫核酸擴增技術）等均可在等溫條件下擴增病毒核酸。這些技術只需要溫度控制裝置來保持一個恒定反應溫度，就可以實現高效的核酸擴增，從而得以擺脫對精密控制溫度變化的 PCR 儀的依賴。若能在常溫條件下實現核酸的擴增，將進一步使核酸擴增技術簡單化，并有利于此類技術更廣范圍的應用。及時準確地發現傳染病疫情對于疾病的防治和疫情的控制具有重要意義，因此研究和開發一種能在基層診療機構使用，在常溫下快速檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型兩種核酸的試劑盒非常有必要。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有柯薩奇病毒A16型（CA16）、腸道病毒71型（EV71）檢測技術的缺陷和不足，研究得到一種同時檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型兩種核酸的RDA熒光法檢測試劑盒，實現對柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的快速檢測，整個檢測過程，從樣本處理到結果完成，僅需20-30min，比常規的檢測時間大大縮短，從而提高檢測效率。

本發明目的在于，提供優選后的用于檢測手足口病病毒的探針，所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO .1-4任一所示，其中SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3的探針用于檢測柯薩奇病毒A16型(CA16)，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4的探針用于檢測腸道病毒71型(EV71)。

本發明另一個目的在于，提供優選后的同時檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型的引物對及探針。