[發明專利]一種快速檢測犬瘟熱病毒（CDV）的RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081179.3
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301151A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 文荻琛;羅寶花;劉華勇;陳翀
• 申請（專利權）人: 廣州普世君安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
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本發明公開一種快速檢測犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）的RDA方法及試劑盒，包括特異性引物對以及RDA熒光標記探針，以實現對犬瘟熱病毒（CDV）的安全、特異、靈敏、簡便的檢測，從而彌補現有傳統檢測技術的不足。本發明中提供的試劑盒可省去核酸提取步驟，在恒溫條件下20min內實現犬瘟熱病毒（CDV）的檢測，特異性為100％，與普通PCR方法相比，RDA熒光法在恒溫下反應，不需變溫，不需復雜儀器，而且反應時間短，適用于現場快速檢測。本發明的方法及其試劑盒具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高、成本低廉等特點，可為犬瘟熱病毒（CDV）現場快速檢測篩查提供有效的技術手段，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域。更具體地，涉及一種基于RDA熒光法檢測技術檢測犬瘟熱病毒（CDV）核酸的引物對、探針及相關試劑盒。

背景技術

犬瘟熱（Canine Distemper,CD）是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus,CDV）感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病，是當前養犬業和毛皮動物養殖業危害最大的疫病。CDV可引起犬、狐、貉和貂等動物發病。近年來，雖然在廣泛應用疫苗防治CD，但是隨著自然環境的改變、動物及病毒的進化，CDV自然感染的宿主范圍還有不斷擴大的趨勢，大熊貓等多種野生動物也有瘟熱自然發病的報道。Mee等甚至從人的變形性骨炎患者體內也檢測到了CDV的核酸，其潛在的公共衛生學意義引起了動物病毒學界及醫學界的普遍關注。因此，早期快速、準確地檢測該病，對于養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護都具有重要意義。

目前，CDV的檢測方法主要有血清中和試驗、免疫熒光技術、酶聯免疫測定技術（ELISA）及分子生物學檢測，其中，血清中和試驗具有嚴格的種、型特異性，可用中和試驗對分離的CDV進行準確的鑒定，但其具有操作麻煩，判定結果時間較長等缺點；免疫熒光技術特異性強，敏感性高，但因其非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足等因素而使其在使用上有一定局限性；ELISA方法要求低，可肉眼判斷結果，但易出現假陽性結果。鑒于這些檢測方法存在以上難以克服的缺點，本試驗以CDV的Ｎ蛋白基因為研究對象，旨在建立特異性強、敏感性高、快速、準確的分子生物學方法，為CDV的早期檢測和流行病學調查提供一種有效的檢測方法。

分子生物學的檢測大多基于PCR，檢測時需要依賴PCR儀或昂貴的實時定量PCR儀，及其它多種配套設備，需配備專門的PCR實驗室和專業操作人員，其成本和應用范圍均受到一定限制。隨著體外核酸恒溫擴增的悄然興起，傳統擴增技術的局限性有所改變，在過去的十年中，使核酸體外擴增變得更加簡單和方便的一些等溫核酸擴增技術已得到快速發展，如LAMP（環介導核酸擴增技術）、HDA（解旋酶依賴等溫核酸擴增技術）等均可在等溫條件下擴增DNA。這些技術只需要溫度控制裝置來保持一個恒定反應溫度，就可以實現高效的核酸擴增，從而得以擺脫對精密控制溫度變化的PCR儀的依賴。若能在更低的溫度條件下，甚至在常溫條件下實現核酸的擴增，將進一步使核酸擴增技術簡單化，并有利于此類技術更廣范圍的應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有犬瘟熱病毒檢測技術的缺陷和不足。研究得到一種犬瘟熱病毒（CDV）RDA熒光法檢測試劑盒，實現犬瘟熱病毒（CDV）的快速檢測，在檢測CDV的整個過程中，從樣本處理到結果完成，僅需20-30min，大大縮短了常規的檢測時間，提高檢測效率。該技術可結合便攜式的樣本處理技術，不依賴于實驗室設備，可采樣現場進行檢測，對犬瘟熱病毒感染等疾病控制具有重要意義。

本發明目的在于，提供優選后的檢測犬瘟熱病毒的靶標序列、引物對及探針。

所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。