[發明專利]一種快速檢測犬瘟熱病毒（CDV）的RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081179.3
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301151A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 文荻琛;羅寶花;劉華勇;陳翀
• 申請（專利權）人: 廣州普世君安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測犬瘟熱病毒（CDV）的探針，其特征在于，所述探針核苷酸序列如SEQ IDNO .1或SEQ ID NO .2所示。

2.如權利要求1所述的檢測犬瘟熱病毒的探針，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ IDNO .1的探針，其5’端標記發光基團，3’端標記淬滅基團，第5-10位堿基中任一位置用四氫呋喃殘基（THF）替代。

3.如權利要求1所述的檢測犬瘟熱病毒的探針，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ IDNO .2的探針，其5’端起第29位堿基T標記發光基團，第31位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第32位堿基標記淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾。

4.一組用于檢測犬瘟熱病毒的靶標序列、引物對及探針，其特征在于，所述探針為權利要求1-3 任一所述探針，所述引物對核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶標序列如SEQ ID NO .5所示。

5.一種檢測犬瘟熱病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸提取試劑、恒溫擴增反應模塊、陽性對照和陰性對照，以及權利要求1-3任一所述的探針及權利要求4所述的引物對。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的恒溫擴增反應模塊為RDA或RPA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑；所述RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的重組酶KX。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括重組酶KX 60-600 ng/μL、KY蛋白16-192 ng/μL、單鏈結合蛋白gp32 100-1000ng/μL、鏈置換DNA聚合酶3-100 ng/μL、反轉錄酶200U、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、Tris緩沖液20~100mM、PEG 2.5%-10%、醋酸鉀或醋酸鈉0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM、DTT 1-12 mM、所述探針150nM-600nM、所述引物對150-600nM。

8.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的核酸提取試劑包括Buffer A、Buffer B；所述Buffer A為樣本裂解液，含有Tris-HCL緩沖體系、NaOH、SDS、EDTA、異硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；所述Buffer B含有Tris緩沖體系、氯化鉀、氯化鎂；所述陽性對照為含有犬瘟熱病毒靶標基因的質粒，所述陰性對照為空載體pUC57質粒。

9.一種非疾病診斷目的檢測犬瘟熱病毒的檢測方法，其特征在于，包含以下步驟：

提取待測樣品的核酸，以待測樣品的核酸為模板，在犬瘟熱病毒的引物對、探針及RDA凍干粉試劑、Buffer A和Buffer B存在下進行實時熒光RDA反應，根據實時熒光RDA擴增曲線分析待測樣品；其中所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示; 其中反應溫度為25-42℃，反應時間大于10分鐘。

10.如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述反應溫度為39℃，所述反應時間為30分鐘。