[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010080872.9
• 申請日: 2020-02-05
• 公開（公告）號: CN111317816A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 翁炳煥;李蘭娟
• 申請（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61P31/14;C12N15/113;C12N15/861
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 孟鵬超

本發(fā)明公開了一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，包括2019?nCoV靶向干擾基因shRNA的擴增、PCR產(chǎn)物的酶切、干擾載體pSilencer?shRNA的構(gòu)建、DH5a轉(zhuǎn)化、穿梭載體pDC312?shRNA的構(gòu)建及其與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxAEl共轉(zhuǎn)染HEK293而制成Ad?shRNA，進而制成Ad?nCoVdsRNA；還包括2019?nCoV抗體表達基因的擴增、PCR產(chǎn)物的酶切、穿梭質(zhì)粒pShuttle?nCoV的構(gòu)建及其經(jīng)DH5a轉(zhuǎn)化、PCR擴增后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAd?nCoV共轉(zhuǎn)染HEK293而制成重組腺病毒Ad?nCoV，進而制成Ad?nCoVDNA；然后以Ad?nCoVdsRNA：Ad?nCoVDNA：H₂0＝1：1：19的比例配制雙價疫苗，經(jīng)呼吸道噴霧接種后，Ad將nCoVdsRNA和nCoVDNA導入細胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于傳染病防治領(lǐng)域的新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，屬于疫苗制備新方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人類冠狀病毒(HcoV 229E和HcoV OC43)可引起達30％的感冒。動物冠狀病毒，如豬胃腸炎冠狀病毒(TGEV)、小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)、鳥傳染性氣管炎冠狀病毒(IBV)等可感染相應(yīng)宿主的呼吸道、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟，導致相應(yīng)癥狀。冠狀病毒的包膜呈花瓣形突起，使冠狀病毒看起來像王冠(拉丁語，corona)，其核衣殼是可變的長螺旋形。冠狀病毒的病毒粒子直徑為60nm～140nm，球形，病毒基因組是27kb～32kb的單鏈正義RNA，是所有RNA病毒基因組中最大的。2003年冠狀病毒的一個變種引起了嚴重急性呼吸綜合征即非典(SARS)的爆發(fā)，SARS-CoV基因組大小為27～3lkb，有14個開放讀碼框(open readingframe， ORF)和1個s2m模序(s2m motif)。

有報道從5名病人體內(nèi)獲得了基本一致的nCoV-2019全基因組，其中有79.5％的序列與 SARS-CoV一致，通過對其保守的7個非結(jié)構(gòu)蛋白進行對比，發(fā)現(xiàn)nCoV-2019屬于SARSr-CoV 的包膜RNA病毒。nCoV-2019含有5'非翻譯區(qū)(UTR)、復制酶復合體(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR以及幾個未知的非結(jié)構(gòu)性開放式閱讀框架。對于nCoV-2019的基因診斷(PCR)，目前中國疾病預防控制中心推薦了針對新型冠狀病毒nCoV-2019的開放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(nucleoprotein，N)基因區(qū)域的引物和探針序列，其中：Target 1(ORF1ab)：正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物(R)：為ACGATTGTGCATCAGCTGA；探針(P)： 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。Target 2(N)：正向引物(F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'。nCoV-2019全基因組序列和功能的分析(A NovelCoronavirus from Patients with Pneumonia in China,2019.The New EnglandJournal of Medicine,2020,January 24)也為nCoV-2019的進一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)，但目前尚缺少有關(guān)nCoV-2019的更確切信息。