[發明專利]一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 202010080872.9
• 申請日: 2020-02-05
• 公開（公告）號: CN111317816A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 翁炳煥;李蘭娟
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61P31/14;C12N15/113;C12N15/861
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 孟鵬超

1.一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，由Ad-nCoV2019dsRNA疫苗和Ad-nCoV2019DNA疫苗按比例配制組成，其中Ad-nCoV2019dsRNA：Ad-nCoV2019DNA：H₂0的體積比＝1：1：19；所述Ad-nCoV2019dsRNA疫苗的制備方法為：擴增nCoV2019的靶向干擾基因shRNA序列，所得產物與空干擾載體pSilencer經BamH I和Hind III酶切而構建干擾載體pSilencer-shRNA，該干擾載體pSilencer-shRNA經感受態大腸桿菌DH5a擴增并經鑒定shRNA插入無誤后與空穿梭載體pDC312經Hind lII和EcoR I酶切而構建穿梭載體pDC312-shRNA，該穿梭載體與腺病毒骨架質粒pBHGloxAEl共轉染HEK293細胞，在該細胞內進行同源重組而獲得重組腺病毒Ad-shRNA，再經HEK293細胞多次擴增后制備Ad-nCoV2019dsRNA；所述Ad-nCoV2019DNA的制備方法為：擴增nCoV2019的抗體表達基因，所擴增的抗體表達基因序列與腺病毒穿梭質粒pShuttle經XbaI和KpnI酶切后構建重組腺病毒穿梭質粒pShuttle-nCoV2019，該穿梭質粒經感受態大腸桿菌DH5a擴增并經XbaI和KpnI酶切鑒定nCoV2019插入無誤后和腺病毒骨架質粒pAd-nCoV2019共轉染HEK293細胞，在HEK293細胞內進行同源重組而獲得重組腺病毒Ad-nCoV2019，該重組腺病毒經HEK293細胞多次擴增后制備Ad-nCoV2019DNA。

2.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述靶向干擾基因shRNA序列指長度為19nt的與siRNA序列互補的RNA序列。

3.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述靶向干擾基因shRNA序列為表達發夾結構的模板，由兩條大部分互補的單鏈DNA構成，經退火互補后能形成帶有BamH I和Hind III酶切位點粘性末端的DNA雙鏈。

4.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述nCoV2019指新型冠狀病毒的保守基因或功能基因序列；所述保守基因或功能基因序列包括ORF1ab、3'UTR、S、E、M、N基因序列。

5.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述pShuttle-nCoV2019指含有nCoV2019的重組腺病毒穿梭質粒；所述pAd-nCoV2019指含有nCoV2019的腺病毒骨架質粒；所述Ad-nCoV2019指含有nCoV2019的復制缺陷型重組腺病毒載體；所述Ad指復制缺陷型重組腺病毒載體。

6.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述Ad-nCoV2019DNA指攜帶抗體表達基因的重組腺病毒。

7.根據權利要求1所述的新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述雙價疫苗接種后，Ad將nCoV2019dsRNA和nCoV2019DNA導入細胞內，其中nCoV2019dsRNA立即通過其shRNA產生dsRNA，即時降解同源的病毒mRNA，nCoVDNA則通過編碼mRNA而表達蛋白，隨后產生抗體而中和病毒。

8.根據權利要求7所述的新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述雙價疫苗通過噴霧接種，Ad將nCoV2019dsRNA和nCoV2019DNA導入呼吸道上皮細胞，nCoV2019dsRNA在細胞內合成dsRNA，繼之特異性誘導同源的nCoV2019 mRNA降解，產生抗nCoV2019的轉錄后基因沉默或RNA干擾，nCoV2019DNA則通過編碼mRNA而表達蛋白，隨后產生抗體而中和病毒。

9.根據權利要求1或6所述的一種新型冠狀病毒肺炎雙價疫苗的制備方法，其特征在于，所述抗體表達基因指能表達mRNA，mRNA表達蛋白，蛋白刺激機體產生抗體的基因。