[發明專利]一種抑制與產生超氧陰離子自由基檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010076483.9
• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111235220A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 冷毅斌;王振平;王長樂;陳冬琴
• 申請（專利權）人: 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 武漢智盛唯佳知識產權代理事務所(普通合伙) 42236
• 代理人: 胡紅林

本發明公開了一種抑制與產生超氧陰離子自由基能力檢測試劑盒，包括以下試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和EDTA制備的基質緩沖液；WST?1和黃嘌呤溶于10mM PBS制成的底物儲備液；含有黃嘌呤氧化酶的酶儲備液；PBS和BSA制成的酶稀釋液；維生素C。本發明適用于動物、植物、細胞和微生物等所有樣本，操作簡便，檢測靈敏度高，樣本用量少，試劑更加環保，測定更加簡便快捷。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種抑制與產生超氧陰離子自由基檢測試劑盒。

背景技術

生物體內超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導的作用，但積累過多時會對細胞膜及生物大分子產生破壞作用，導致機體細胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病；故生物體中超氧陰離子的抑制劑和產生超氧陰離子自由基的物質的檢測及處理成為研究熱點。

現有市面上有售抑制與產生超氧陰離子自由基檢測試劑盒采用的是羥胺法，顯色體系需要加熱、試劑組份多、用到刺激性氣味的乙酸、整個顯色體系是酸性的；客戶現配試劑比較多、操作麻煩，人為誤差較大，檢測時間很長(用分光光度計檢測，需要三個數據洗一次比色皿)。

WST-1可以和黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)催化產生的超氧化物陰離子(O₂^.-)反應產生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，使反應體系呈現黃色，可用酶標儀450nm測其吸光度，其原理如圖1所示。當被測樣本中含有超氧陰離子自由基抑制劑時，則比色時測定孔的OD值低于對照孔的OD值；而如果被測樣本中含有產生超氧陰離子自由基物質時，則比色時測定孔的OD值高于對照孔的OD值。基于以上研究，可用來檢測待測樣本對超氧陰離子自由基的影響能力。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種抑制與產生超氧陰離子自由基檢測試劑盒，采用該試劑盒進行檢測，操作方便且靈敏度高。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種抑制與產生超氧陰離子自由基檢測試劑盒，包含以下試劑：基質緩沖液，底物儲備液，酶儲備液，酶稀釋液，標準品；

所述基質緩沖液為由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和EDTA制備，pH為7.8-8.4，所述磷酸氫二鈉的含量為17-20g/L，所述磷酸二氫鉀的含量為1.95-2.75g/L，所述EDTA的含量為0.1-0.5g/L；

所述底物儲備液為含有WST-1和黃嘌呤的PBS緩沖液，其中，WST-1的含量為6.5-10mg/mL，黃嘌呤的含量為18-25mg/mL，所述PBS緩沖液的濃度為10mM；

所述酶儲備液為含有黃嘌呤氧化酶和牛血清蛋白的PBS緩沖液，所述黃嘌呤氧化酶的含量為16.6-18.2U/mL，所述牛血清蛋白的含量為0.2-1.0％；

所述酶稀釋液為含有牛血清蛋白的PBS緩沖液，所述PBS緩沖液的濃度為50mM，所述牛血清蛋白的含量為0.2-1.0％；

所述標準品為維生素粉劑。

本發明還提供了一種檢測樣品抑制與產生超氧陰離子自由基活力的方法，其特征在于，使用上述試劑盒，具體步驟如下：

S1、提取血清、血漿、組織或細胞樣品，得待測樣本；

S2、酶標板上設置對照孔、對照空白孔、標準孔、標準品空白孔、測定孔以及測定空白孔，其中，對照孔加入雙蒸水和酶儲備液，對照空白孔加雙蒸水和酶稀釋液，標準孔加標準品和酶儲備液，標準空白孔加標準品和酶稀釋液，測定孔加待測樣本和酶儲備液，測定空白孔加待測樣本和酶稀釋液；

S3、向步驟S1中的各孔加等體積的底物應用液，并小心吹打混勻；

S4、特定溫度下孵育固定時間，酶標儀450nm測OD值；