[發(fā)明專利]一種抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基檢測試劑盒

在審

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• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111235220A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 冷毅斌;王振平;王長樂;陳冬琴
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 武漢智盛唯佳知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 42236
• 代理人: 胡紅林

1.一種抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基檢測試劑盒，其特征在于，包含以下試劑：基質(zhì)緩沖液，底物儲備液，酶儲備液，酶稀釋液，標準品；

所述基質(zhì)緩沖液為由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和EDTA制備，pH為7.8-8.4，所述磷酸氫二鈉的含量為17-20g/L，所述磷酸二氫鉀的含量為1.95-2.75g/L，所述EDTA的含量為0.1-0.5g/L；

所述底物儲備液為含有WST-1和黃嘌呤的PBS緩沖液，其中，WST-1的含量為6.5-10mg/mL，黃嘌呤的含量為18-25mg/mL，所述PBS緩沖液的濃度為10mM；

所述酶儲備液為含有黃嘌呤氧化酶和牛血清蛋白的PBS緩沖液，所述黃嘌呤氧化酶的含量為16.6-18.2U/mL，所述牛血清蛋白的含量為0.2-1.0％；

所述酶稀釋液為含有牛血清蛋白的PBS緩沖液，所述PBS緩沖液的濃度為50mM，所述牛血清蛋白的含量為0.2-1.0％；

所述標準品為維生素粉劑。

2.一種檢測樣品抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基活力的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的試劑盒，具體步驟如下：

S1、提取血清、血漿、組織或細胞樣品，得待測樣本；

S2、酶標板上設(shè)置對照孔、對照空白孔、標準孔、標準品空白孔、測定孔以及測定空白孔，其中，對照孔加入雙蒸水和酶儲備液，對照空白孔加雙蒸水和酶稀釋液，標準孔加標準品和酶儲備液，標準空白孔加標準品和酶稀釋液，測定孔加待測樣本和酶儲備液，測定空白孔加待測樣本和酶稀釋液；

S3、向步驟S1中的各孔加等體積的底物應用液，并小心吹打混勻；

S4、在特定溫度下孵育固定時間，酶標儀450nm測OD值；

S5、計算抑制率，抑制率在20％-60％之間，檢測結(jié)果可靠，當抑制率大于60％時，需將待測樣本進行稀釋后在此按上述步驟檢測；

抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基活力的計算方式具體如下：

待測樣本為血清血漿樣本時

其中，A1＝對照OD值-對照空白OD值，A2：測定OD值-測定空白OD值，A3：標準OD值-對照空白OD值，C：標準品的濃度，f：樣本測試前的稀釋倍數(shù)；

U1的定義為：在反應體系中，每毫升血清(漿)在特定溫度下孵育固定時間所抑制的超氧陰離子自由基相當于1mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位；

待測樣本為細胞、細菌、組織時

其中，A1：對照OD值-對照空白OD值，,A2：測定OD值-測定空白OD值，A3：標準OD值-對照空白OD值，C：標準品的濃度(0.15mg/mL)C_pr：待測樣本的蛋白濃度gprot/L；

U2的定義為：在反應體系中，每克蛋白在特定溫度下孵育固定時間所抑制的超氧陰離子自由基相當于1mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在將各試劑加入酶標孔時，應觸酶標板底緩慢加樣。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中采用多道移液器添加底物應用液。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S4所述的溫度為32-40℃，所述孵育時間為10-30min。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S4所述的溫度為37℃，所述孵育時間為20min。