[發明專利]免疫印跡一步法

有效

• 申請號: 202010076482.4
• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111257557B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 黃長青;程瑤;雷雅君;趙騫
• 申請（專利權）人: 武漢愛博泰克生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/541
• 分類號: G01N33/541
• 代理公司: 武漢世躍專利代理事務所(普通合伙) 42273
• 代理人: 倪婭

本發明提供了一種免疫印跡一步法，該方法從現有一抗中篩選出符合條件的一抗，使得一抗與二抗能同時和待測樣品孵育，相對于常規免疫印跡的一抗二抗分開孵育的步驟，本發明將孵育過程從兩步改成一步，且孵育后，簡單洗滌即可進行發光或顯色檢測，操作簡單，縮短實驗周期、提高檢測效率。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種免疫印跡一步法。

背景技術

免疫印跡試驗即Western Blot，它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織蛋白樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

Western Blot常規實驗流程為：制膠→電泳→轉膜→封閉→一抗→二抗→曝光，實驗周期長，整個流程花費的時間在2天左右，實驗流程復雜，且需要多步條件優化。

發明內容

有鑒于此，本發明通過篩選合適條件的一抗和二抗，將一抗和二抗混合一起孵育，在保證實驗靈敏度的情況下，縮短了Western Blot的實驗周期，提高檢測效率。

為實現上述目的，本發明所提供的免疫印跡一步法，采用的試劑包括二抗和良級一抗，步驟為：

a)樣品依次進行電泳、轉膜；

b)轉膜后，將印跡膜與二抗和良級一抗同時孵育，直至達到后續顯色標準；

c)隨后洗膜進行顯色；

其中，所述二抗為與良級一抗能匹配使用的二抗；

所述良級一抗為通過抗體分級方法檢測的一抗；所述抗體分級檢測方法為：采樣三個或以上不同生物類別來源的樣本，經常規免疫印跡實驗檢測后，進行曝光，所產生條帶結果滿足條件的為良級一抗，所述條件為：

1)至少3個泳道有單一目的條帶，有目的條帶的泳道無雜帶，其余泳道無帶；

或2)至少3個泳道有單一目的條帶且有目的條帶的泳道有雜帶，雜帶位于與目的條帶間隔2個marker以上的位置；

所述條帶為經圖像識別軟件分析，灰度值180以上的條帶。

上述方案中，所述檢測到目的條帶的常規方法為肉眼可見或通過Image J分析，灰度值180。

優選地，所述抗體分級檢測方法中，同一生物類別來源的所述樣本的數量大于等于3。

優選地，所述生物類別為人、小鼠和大鼠。

優選地，上述方案在執行時，優選采用9個樣本(來源于3鐘不同生物)，檢測后有1/3或以上的樣本產生目的條帶。

優選地，所述抗體分級檢測方法中，常規免疫印跡實驗檢測時，總蛋白上樣量為30μg，抗體1:1000稀釋；曝光時間為1s。

優選地，所述步驟b)中孵育過程還添加有穩定劑、保護劑、防腐劑，其中，所述防腐劑為硫柳汞，所述保護劑為氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀，所述穩定劑為甘油。

優選地，所述步驟b)中孵育時間為90～120min。

優選地，所述步驟c)洗膜為多次，采用洗劑為TBST。

現對于現有技術，本發明的有益效果為：

1.試劑穩定性好，需要在2-8℃保存，如果長期不用可于-20℃保存，至少半年有效。

2.通過控制試劑中一抗和二抗的比例，在保證實驗靈敏度的情況下，使一抗和二抗穩定共存。