[發明專利]一種兜蘭植物高質量總RNA的提取方法及應用

在審

• 申請號: 202010076386.X
• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111073887A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 丁勇;常瑋;邵亞林;劉小燭
• 申請（專利權）人: 西南林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張雪

本發明公開了一種兜蘭植物高質量總RNA的提取方法，包括：步驟1：液氮中研磨兜蘭植物成熟葉片成粉末，向所得粉末中加入Trizol試劑和β?巰基乙醇，渦旋振蕩充分裂解，得到裂解液；步驟2：將裂解液離心取上清液，并向上清液中加入氯仿，振蕩混勻，室溫靜置、離心,取上清液；步驟3：重復步驟2操作2?3次，之后,向所得上清液中加入沉淀劑，充分混勻后，?20℃靜置10?15min；步驟4：將上述靜置結束的混合液離心，棄上清取沉淀，并用洗滌液洗滌沉淀2?3次，離心，棄洗滌液后，風干，得到產品RNA。該方法是在Trizol法基礎上進行了改良，所得RNA純度高，完整性好，為后續開展相關試驗研究提供根本性基礎。

技術領域

本發明涉及分子生物學核酸提取領域，特別是涉及一種兜蘭植物高質量總RNA的提取方法及應用。

背景技術

兜蘭又稱拖鞋蘭，蘭科多年生草本，多數為地生種，雜交品種較多，是栽培最普及的洋蘭之一。近些年，兜蘭的研究主要集中在形態結構、組織培養與快速繁殖、遷地保護、雜交育種、光合生理和引種栽培等方面，而其分子生物學方面的研究涉及到親緣關系和系統分類。兜蘭作為頗有價值的觀賞植物，發展前景較好，但同時受到自然分布區域的限制和野生資源的破壞，導致其種質資源的保護和應用急需開辟新的途徑，而高質量的RNA獲得是進行相關途徑研究的前提。

兜蘭屬植物富含酚類、多糖等次生代謝產物，發明人前期研究發現其基因組RNA提取存在困難，因此，尋找適合兜蘭總RNA提取的方法是分子生物學研究的關鍵。但是，多數兜蘭葉片具有革質化和肉質化特性，總RNA提取較困難。而目前常用的提取植物RNA的方法有多種，比如：試劑盒法、CTAB法、Trizol法，這些方法已經應用于多種植物總RNA的提取，但是針對不同的植物由于其內含有的物質不同，所以提取效果也參差不齊，并且截至目前為止未見報道關于兜蘭總RNA提取方法的研究，而針對現有提取RNA的境況，尋找一種兜蘭植物高質量RNA的提取方法對于進一步開展基因克隆、轉錄組測序分析等將具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種兜蘭植物高質量總RNA的提取方法及應用，以解決上述現有技術存在的問題，該方法是在Trizol法基礎上進行了改良，使得所提取的RNA純度高，完整性好，適合多種兜蘭植物總RNA的提取。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種兜蘭植物高質量總RNA的提取方法，包括以下步驟：

步驟1：液氮中研磨兜蘭植物成熟葉片成粉末，向所得粉末中加入Trizol試劑和β-巰基乙醇，渦旋振蕩充分裂解，得到裂解液；

步驟2：將裂解液離心取上清液，并向上清液中加入氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min后離心,取上清液；

步驟3：重復步驟2的操作2-3次，向所得上清液中加入沉淀劑，充分混勻后，-20℃靜置10-15min；

步驟4：將步驟3中靜置結束的混合液離心，棄上清取沉淀，并用洗滌液洗滌所述沉淀2-3次，離心，棄洗滌液后，風干，得到產品RNA。

優選的是，步驟1中所述粉末：Trizol試劑按質量體積比為1:10添加，所述粉末：β-巰基乙醇按質量體積比為1：0.2添加。

優選的是，步驟3中所述沉淀劑為預冷的異丙醇，所述預冷的異丙醇為4℃冷處理0.5-1.0h，所述預冷的異丙醇與步驟3中所述上清液等體積添加；

優選的是，步驟4中所述洗滌液為體積分數為75％乙醇。

優選的是，步驟1-步驟4中離心條件均為：4℃ 12000rpm離心5min。

優選的是，步驟4中棄去洗滌液后，在超凈工作臺風干5-10min，然后用DEPC水溶解沉淀，于-80℃保存。