[發明專利]一種結核分枝桿菌刺激抗原的制備方法

有效

• 申請號: 202010076333.8
• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111269297B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 劉梁濤;李新樂;尚朋林;張文婧;趙巧輝;李歡歡;李桂林;付光宇;吳學煒;楊增利
• 申請（專利權）人: 鄭州伊美諾生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及生物醫學檢驗領域，尤其涉及結核分枝桿菌刺激抗原及其制備方法。本發明提供的結核分枝桿菌刺激抗原其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或與其具有至少80％序列同源性的序列。并且還提供了編碼該抗原片段的多核苷酸、表達載體，以及重組產結核分枝桿菌刺激抗原的大腸桿菌菌株，并通過控制培養及發酵誘導條件，實現重組大腸桿菌的高密度培養的同時，避免了后期因自身所產生的蛋白對菌體所帶來的異常現象。該抗原在刺激γ?干擾素的產生時，能夠降低干擾，從而使檢測具有更好的特異性和靈敏度，檢測結果更加可靠。

技術領域

本發明涉及生物醫學檢驗領域，尤其涉及結核分枝桿菌刺激抗原及其制備方法。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌(tubercle bacillus，TB)感染引起的人畜共患的慢性傳染病。結核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結核病。結核病是青年人容易發生的一種慢性和緩發的傳染病。潛伏期4～8周。其中80％發生在肺部，其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼)也可繼發感染。人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。結核病的病因包括：①原發性：當人體抵抗力降低時，經呼吸道或消化道初次侵入人體的結核菌，常在肺部或腸壁形成原發病灶。②血型播散：當機體抵抗力降低時，大量結核菌一次或在極短時間內多次侵入血循環而引起，此時，由于機體變態反應增高，可致血管通透性增強。③繼發性：指原發感染過程中肺內遺留下的潛在性病灶重新復燃或結核桿菌再次感染所引起的。我國是結核病流行嚴重的國家之一、同時也是全球耐多藥結核病流行嚴重的國家之一，人類的健康受到了結核病的嚴重威脅。結核分枝桿菌的檢測對結核病的診斷和防治存在重要意義。

近年來，隨著免疫學和基因組學的發展，利用雙抗體夾心ELISA法定量測釋放出的IFN-γ含量，IFN-γ的含量與結核菌的量有很好的對應關系，從而判斷是否感染結核分枝桿菌。目前已經有以結核分枝桿菌基因組RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10為刺激物的商品化IGRA試劑，用于檢測外周血中結核特異性釋放γ干擾素的T淋巴細胞，呈現較高的靈敏性和特異性。

但是，目前的結核分枝桿菌刺激抗原序列在制備過程中，菌株死亡較多，出現自溶的現象，其溶氧及pH變化較大，收菌離心后，出現離心分層現象較為嚴重，同時蛋白的表達率較低，在大量制備結核分枝桿菌刺激抗原時需要多批次培養，延長了抗原獲取周期，且在高密度/高表達發酵控制過程中，發酵液中葡萄糖、乙酸含量需要得到控制，葡萄糖、乙酸常規的檢測方法易受培養基成分、菌體代謝產物的影響測定結果，不僅造成了檢測的不準確性，還增加了成本，并且最終得到的結核分枝桿菌刺激抗原純度較低，使得結核檢測靈敏度較低。

雖然很多學者克隆出不少的結核刺激抗原相似基因，也都在酵母、大腸桿菌等表達體系中進行表達，但表達分泌能力較弱，到現在為止并沒有可以應用于大規模生產的工程菌。究其原因，可能在于選取的序列并不合適，或者未獲得蛋白表達較高菌株做為克隆模板，表達穩定性差等。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供結核分枝桿菌刺激抗原及其制備方法，該抗原片段表達量高，純度良好，用于刺激γ-干擾素可以提高特異性。

本發明提供的結核分枝桿菌刺激抗原，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或與其具有至少80％序列同源性的序列。

一些實施例中，所述結核分枝桿菌刺激抗原具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。該實施例中，所述結核分枝桿菌刺激抗原的分子量為23.1Kda。

本發明在研究過程中，根據抗原的cds區，設計了數個TB結核桿菌的刺激抗原，進行了大量的篩選驗證工作，其中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的抗原片段具有最佳的表達效果，其余片段在表達過程中表達分泌能力較弱，無法應用于大規模生產。

本發明還提供了編碼所述結核分枝桿菌刺激抗原的多核苷酸。