[發明專利]一種體外模擬細胞因子釋放對間接靶細胞表型影響的方法

在審

• 申請號: 202010075799.6
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN113150981A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 張斌;孫耀;趙龍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第五醫學中心
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12M1/00;C12N5/10;C12N5/09;C12N5/077;C12N5/0781;C12N5/0783;C12N5/0786
• 代理公司: 上海市錦天城律師事務所 31273
• 代理人: 汪妍瑜

本發明為一種體外模擬細胞因子釋放對間接靶細胞表型影響的方法，涉及免疫細胞研究領域，特別是CAR?T細胞與其對應靶細胞共孵育時其細胞因子對間接靶細胞表型影響的體外研究。CRS體外模型是在Corining Transwell 12孔板(0.4μm孔徑，12mm底面積)中，上層隔室加入CART細胞(A細胞)和對應靶細胞(B細胞)，下層12孔板中加入間接靶細胞(C細胞，包括HUVEC，PBMCs，CD34+磁珠分選后的G?PBMCs)。小于0.4μm孔徑物質可自由通過(如細胞因子)，而細胞無法自由通過，從而模擬CAR?T細胞與腫瘤細胞接觸時釋放細胞因子對HUVEC等間接靶細胞表型的影響。

技術領域

本發明涉及免疫治療中細胞因子釋放研究領域，特是CAR-T細胞與其對應靶細胞共孵育時其細胞因子釋放對間接靶細胞的體外研究。

背景技術

自2010年以后，嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor modified-T cells,CAR- T)療法取得不斷突破，在急性淋巴細胞白血病，B細胞淋巴瘤，多發性骨髓瘤、等多種血液腫瘤和部分實體瘤顯示出良好的療效。2017年，美國FDA批準兩項CAR-T藥物上市。CAR-T廣泛應用的同時也帶來了許多不良反應，其中最常見最嚴重的是細胞因子釋放綜合癥(Cytokine release syndrome,CRS)。CRS是在90年代T 細胞單抗OKT3治療中第一次定義的。目前大多數臨床常用的單克隆抗體CRS發生率較低，但在基于T細胞的免疫療法中發生率相當高，這些療法多在臨床早起發展階段，包括雙特異性抗體(dual-affinityretargeting antibodies,DART),T-cell receptor modified-T cells(TCR-T)或CAR-T，其中CAR-T治療后CRS發生率最高。CAR-T 治療后CRS，以發熱，高血壓，凝血功能異常，毛細血管滲漏等為主要表現。接受治療的患者中，約54-91％發生CRS，嚴重CRS發生率為8.3-43％。CRS發生的主要機制目前尚不完全清楚，主要是CAR-T回輸到體內后識別抗原陽性的靶細胞(腫瘤細胞或正常細胞)或者其他T細胞腫瘤免疫療法導致T細胞大量活化、增殖，殺傷靶細胞并且大量釋放細胞因子。所釋放的細胞因子進一步活化旁觀者免疫細胞(單核細胞，巨噬細胞，T細胞，B細胞等)或者非免疫細胞(如內皮細胞)，導致這些細胞釋放大量細胞因子，形成瀑布效應從而導致CRS的發生，并出現相應的臨床癥狀。[1,2]。

參見附圖1，CAR-T細胞回輸后識別腫瘤細胞，活化擴增并釋放IL-6、IL-10、 GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等細胞因子，激活體內免疫細胞如單核/巨噬細胞、T細胞和DC細胞，以及非免疫細胞如內皮細胞，擴大細胞因子釋放的數量及種類。此外，IL-6及sIL-6Rα可通過gp130作用于大多數細胞。腎上腺素通過單核/巨噬細胞以及T細胞，在刺激誘導下α1-和α2-腎上腺素能受體水平會升高，并增加細胞因子及兒茶酚胺類激素(腎上腺素，去甲腎上腺素及多巴胺)釋放，進一步加重炎癥

在CRS中，活化的T細胞釋放IL-2，sIL-2Rα，IL-6，sIL-6R，GM-CSF，IFN-γ等細胞因子和趨化因子，其他旁觀者免疫細胞，如單核/巨噬細胞(釋放IL-1Ra，IL- 10，IL-6，IL-8，CXCL10(IP-10)，CXCL9(MIG)，IFN-α，CCL3(MIP-1α)， CCL4(MIP-1β)，以及sIL-6R，樹突狀細胞(DC)等[3]。近兩年研究表明，內皮細胞及單核/巨噬細胞的激活，在CRS的發生發展中起著越來越重要的作用。[1,4-7] 進一步研究CRS狀態下，機體內正常細胞，尤其是免疫細胞在免疫表型及功能上發揮的變化，成為更深入了解CRS的重要途徑。

此外，CD123分子是目前AML治療的重要靶點，但在CAR-T治療及單抗藥物治療的臨床試驗中，出現了造血系統抑制、內皮細胞滲漏綜合征(CLS)、CRS等嚴重的毒副作用。[8,9]據文獻報道，CD123在HUVEC細胞中可被IFN-γ，TNF-α等誘導表達[10,11]。因此，研究CRS狀態下CD123在各種細胞中的表達變化情況尤為重要。