[發明專利]菲律賓蛤仔APE基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途

有效

• 申請號: 202010074763.6
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN111073894B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 聶鴻濤;姜坤銀;閆喜武
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

本發明公開一種菲律賓蛤仔APE基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途，菲律賓蛤仔APE基因片段核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；編碼蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。編碼蛋白的制備方法按如下步驟進行：提取菲律賓蛤仔總RNA；將總RNA反轉錄合成cDNA；c.PCR擴增目標基因：以所得到的cDNA為模板、以核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3~SEQ?ID?NO：4所示的PCR反應引物進行PCR反應；回收純化DNA片段，進而將純化DNA片段轉入大腸桿菌表達菌株中進行誘導培養得到菌體，而后純化、復性即可。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種菲律賓蛤仔APE基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途。

背景技術

微生物表達的特殊分子被稱為病原體相關分子模式（PAMPs），如革蘭陰性菌中的脂多糖（LPS）、革蘭陽性菌中的肽聚糖（PGN）和脂磷壁酸（LTA）、酵母中的甘露聚糖、病毒中雙鏈RNA及細菌中非甲基化CpG基序等，機體先天免疫系統依賴于模式識別蛋白（PRPs）來檢測病原體相關分子模式（PAMPs）并與之發生反應。目前在動物體內發現了多種基于不同蛋白質結構域和不同PAMP特性的模式識別蛋白PRPs，包括Toll樣受體（TLRs）、NOD樣受體（NLRs）、清道夫受體（SRs）、C型凝集素受體（CLRs）、肽聚糖識別蛋白（PGRPs）、革蘭氏陰性菌結合蛋白（PGRPs）等。黃廣瑞在文昌魚中發現了一種新型的模式識別蛋白（Apextrin，APE），該蛋白通過一個新的模式識別結構域ApeC與MDP結合。如在青島文昌魚（Branchiostomajaponicum）中發現的BjApextrin1?和BjApextrin2?分別作為細胞外效應PRPs和細胞內傳感器PRPs識別PGN和MDP。但是，在貝類關于Apextrin基因的研究還比較少，其蛋白功能的研究尚未有報道。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種菲律賓蛤仔APE基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途。

本發明的技術解決方案是：一種菲律賓蛤仔APE基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1?所示。

一種上述菲律賓蛤仔APE基因片段編碼蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ?IDNO：2所示。

一種上述菲律賓蛤仔APE基因片段編碼蛋白的制備方法，依次按如下步驟進行：

a.提取菲律賓蛤仔RNA并反轉錄合成cDNA；

b.?以所得到的cDNA為模板，進行PCR反應，所述PCR反應上下游引物

的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：3?和SEQ?ID?NO：4所示；所述PCR反應條件是94℃變性5min；94?℃變性30s、58℃退火30s、72?℃延伸2min、進行35個循環；72?℃延伸5min；

c.?純化回收長度為bp1600左右的擴增片段并通過連接酶與克隆載體進行

連接，轉入TOP10?感受態后篩選陽性克隆，提取質粒；使用 NcoI/XhoI酶切質粒，對酶切質粒產生的目的片段純化回收；

d.?將純化回收的目的片段與經 NcoI/XhoI酶切的表達載體pET-28a?(+)連接

在含?30?μg/ml?卡那霉素和?34?μg/ml?氯霉素的培養基中培養菌體，當?OD?值達到?0.6?時，添加?0.5?mM?誘導劑?IPTG，20℃培養過夜，離心收集細胞菌體；