[發(fā)明專利]菲律賓蛤仔APE基因片段、編碼蛋白、制備方法及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010074763.6
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN111073894B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶鴻濤;姜坤銀;閆喜武
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種菲律賓蛤仔APE基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1?所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述菲律賓蛤仔APE基因片段編碼蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

3.一種如權(quán)利要求2所述菲律賓蛤仔APE基因片段編碼蛋白的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a.提取菲律賓蛤仔RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

b.以所得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：3?和SEQ?ID?NO：4所示；所述PCR反應(yīng)條件是94?℃?變性5min；94?℃變性30s、58℃退火30s、72?℃延伸2min、進(jìn)行35個循環(huán)；72?℃延伸5min；

c.純化回收長度為bp1600左右的擴(kuò)增片段并通過連接酶與克隆載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入TOP10?感受態(tài)后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒；使用NcoI/XhoI酶切質(zhì)粒，對酶切質(zhì)粒產(chǎn)生的目的片段純化回收；

d.將純化回收的目的片段與經(jīng)NcoI/XhoI酶切的表達(dá)載體pET-28a?(+)連接在含?30?μg/ml?卡那霉素和?34?μg/ml?氯霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，當(dāng)?OD?值達(dá)到?0.6?時，添加0.5?mM?誘導(dǎo)劑?IPTG，20℃培養(yǎng)過夜，離心收集細(xì)胞菌體；

e.?細(xì)胞菌體用緩沖液溶解、超聲破碎，離心收集上清粗蛋白；取?5?ml?Ni-NTA柱，用5倍柱床體積的?Binding?buffer?清洗平衡柱子，流速?5?ml/min；將粗蛋白與平衡后的柱填料孵育?1?h上柱；用?Binding?buffer?清洗平衡柱子；用?Washing?buffer?洗柱子后再用濃度為20?mM的Imidazole洗脫并收集洗脫液；將洗脫液透析到蛋白保存緩沖液中，所述蛋白保存緩沖液組成為50?mM?Tris，300?mM?NaCl，0.1%?SKL，2?mM?DTT，pH?8.0中，透析結(jié)束后用?PEG20000濃縮，0.45μm?濾膜過濾后保存。

4.一種如權(quán)利要求1所述菲律賓蛤仔APE基因片段編碼蛋白在制備抑制革蘭氏陽性菌藥物中的應(yīng)用。