[發(fā)明專利]一種預(yù)防骨質(zhì)疏松乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010069583.9
• 申請(qǐng)日: 2020-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN111704664A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)m威;張基亮;韓雪;公丕民;陳世偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/79
• 分類號(hào): C07K14/79;C07K1/34;C07K1/107;A61P19/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種預(yù)防骨質(zhì)疏松乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物的制備方法，具體順序?yàn)榕渲迫殍F蛋白溶液，然后與單糖在特定條件下糖基化，獲得兩種糖基化產(chǎn)物比乳鐵蛋白促成骨細(xì)胞增殖活性分別提高15.7%和11.3%，抑制細(xì)胞凋亡分別提高3.1%和1.2%、堿性磷酸酶分泌分別提高23.2%和20.1%，細(xì)胞周期中分別延長(zhǎng)G2/M期73.2%和63.3%、S期68.3%和72.1%，縮短G1/G0期分別12.3%和12.0%，使JNK蛋白磷酸化水平表達(dá)分別提高?37.5%和28.8%、使ERK1/2蛋白磷酸化水平的表達(dá)提高100.9%和66.0%、使p38蛋白磷酸化水平的表達(dá)提高2.7%和74.3%，可以有效地提高牛乳鐵蛋白抑制骨質(zhì)疏松功能。該制備方法只需一步操作就可以完成，條件容易控制、適合產(chǎn)業(yè)化，修飾后的糖基化產(chǎn)物溶解性良好。經(jīng)鑒定這兩種糖基化蛋白在Lys47、Lys329和Lys627有共同的結(jié)合位點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品蛋白改性技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種預(yù)防骨質(zhì)疏松乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物的制備方法。該方法獲得的產(chǎn)物具有顯著的抑制骨質(zhì)疏松活性，并且其中一種產(chǎn)物使細(xì)胞增殖途徑與天然人乳鐵蛋白的途徑一致。。

背景技術(shù)

對(duì)于嬰兒而言，母乳蛋白是最為理想的，但是由于多種原因只能用牛乳或其他動(dòng)物乳來替代母乳喂養(yǎng)。乳鐵蛋白是乳中具有多功效性的糖蛋白，其生物學(xué)性質(zhì)包括預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫調(diào)節(jié)性和酶活性等，目前乳鐵蛋白被廣泛應(yīng)用于保健食品、配方奶粉、醫(yī)藥等領(lǐng)域中，但資源有限，因此提高乳鐵蛋白生物學(xué)活性是緩解乳鐵蛋白供需矛盾的有效途徑。本發(fā)明通過糖基化獲得和人乳鐵蛋白相同作用途徑的牛乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物，旨在提高牛乳鐵蛋白的促成骨細(xì)胞增殖活性，達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。

增加乳鐵蛋白活性，提高其利用效率，從而降低對(duì)乳鐵蛋白的需求量受到廣泛關(guān)注。目前，有一篇文獻(xiàn)認(rèn)為，乳鐵蛋白的糖基化修飾可以提高其抗氧化性，另一篇?jiǎng)t是報(bào)道了糖基化修飾后的乳鐵蛋白其消化性有所改變。

利用糖基化技術(shù)來獲得具有高活性抑制骨質(zhì)疏松的乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物、同時(shí)其增殖途徑與天然人乳鐵蛋白一致已經(jīng)成為一個(gè)新的方向。如何穩(wěn)定提高活性、研究結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系是本領(lǐng)域急需解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：提供一種預(yù)防骨質(zhì)疏松乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物的制備方法，獲得具有高活性抑制骨質(zhì)疏松的乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物。

技術(shù)問題：本發(fā)明通過糖基化牛乳鐵蛋白技術(shù)，獲得的產(chǎn)物和天然人乳鐵蛋白具有相同的促進(jìn)骨細(xì)胞增殖作用途徑，提高了其抑制骨質(zhì)疏松的活性。

技術(shù)方案：一種預(yù)防骨質(zhì)疏松乳鐵蛋白糖基化產(chǎn)物的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單、易于操作、提高抑制骨質(zhì)疏松的活性、具有和天然人乳鐵蛋白相同的作用途徑，按照以下步驟進(jìn)行：

（1）乳鐵蛋白糖基化的制備：將一定量的牛乳鐵蛋白用去離子水溶解，按照質(zhì)量比1:1-1:10的比例加入葡萄糖、果糖或半乳糖，充分溶解后，將該溶液置于水浴鍋中，于40-90℃反應(yīng)12-80 h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于-30-20℃的環(huán)境中10-40 min；

（2）糖基化產(chǎn)物預(yù)處理：用分子量為5-50 kDa的透析袋，體積為3-5 L的去離子水透析48-96 h。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定的結(jié)果，將糖基化產(chǎn)物的濃度調(diào)整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm濾膜除菌備用；

（3）糖基化產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用：將100 μL濃度為1×10⁴-1×10⁶個(gè)/mL的成骨細(xì)胞溶液于96孔板中過夜培養(yǎng)，加入不同的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，兩種糖基化產(chǎn)物比未修飾的乳鐵蛋白顯著地促成功細(xì)胞增殖，二者的通路分別與天然牛乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白一致。