[發明專利]一種預防骨質疏松乳鐵蛋白糖基化產物的制備方法

在審

• 申請號: 202010069583.9
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111704664A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 張蘭威;張基亮;韓雪;公丕民;陳世偉
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/34;C07K1/107;A61P19/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高活性預防骨質疏松乳鐵蛋白糖基化產物的制備方法，其特征在于，該方法只需一步操作就可以完成乳鐵蛋白的糖基化修飾，修飾后的糖基化產物無需凍干、溶解性良好、促成骨細胞增殖活性高、MAPK細胞增殖通路分別與天然牛乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白一致，該方法按照以下步驟進行：

（1）乳鐵蛋白糖基化產物的制備：將一定量的牛乳鐵蛋白用去離子水溶解，按照質量比1:1-1:10的比例加入葡萄糖、果糖或者半乳糖、充分溶解后，將該溶液置于水浴鍋中，于40-90℃反應12-80 h，反應結束后將溶液置于-30-20℃的環境中10-40 min；

（2）糖基化產物預處理：用分子量為5-50 kDa的透析袋，體積為3-5 L的去離子水透析48-96 h，根據BCA試劑盒測定的結果，將糖基化產物的濃度調整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm濾膜除菌備用；

（3）糖基化產物對成骨細胞增殖作用；將100 μL濃度為1×10⁴-1×10⁶個/mL的成骨細胞于96孔板中過夜培養，加入不同濃度的糖基化產物，獲得兩種糖基化產物比未修飾的乳鐵蛋白顯著地促成骨細胞增殖，二者促骨細胞增殖的通路分別與天然牛乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白一致。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳鐵蛋白糖基化產物較未修飾的乳鐵蛋白的抑制骨質疏松的活性顯著地提高。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于通過MAPK通路對兩種糖基化產物的增殖途徑進行分析，發現兩種產物的作用途徑與天然牛乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白增殖相一致，但活性更好。

4.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于步驟（1）乳鐵蛋白糖基化產物制備，將一定量的牛乳鐵蛋白用去離子水溶解，按照質量比1:1-1:10的比例加入單糖、充分溶解后，將該溶液置于水浴鍋中，于40-90℃反應12-80 h，反應結束后將溶液置于-30-20℃的環境中10-40 min；步驟（2）糖基化產物預處理，用分子量為5-50 kDa的透析袋，體積為3-5 L的去離子水透析48-96 h，根據BCA試劑盒測定的結果，將糖基化產物的濃度調整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm濾膜除菌備用。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法：乳鐵蛋白糖基化產物溶解性良好、抑制骨質疏松活性高、MAPK細胞增殖通路分別與天然牛乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白一致。