[發明專利]竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物及其應用

有效

• 申請號: 202010069452.0
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111172312B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 祁浩然;楊春霞;胥猛
• 申請（專利權）人: 南京林業大學;江西省林業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物及其應用，屬于分子生物學技術領域。本申請設計了29對特異性竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.58所示，產物平均片段約3.7kb，以Sanger測序法進行測序和拼接驗證，其結果與通過提取葉綠體DNA進行高通量測序的結果一致，得到竹柏葉綠體基因組序列長度為133724bp，長葉竹柏的葉綠體基因組序列為133777bp。表明本發明引物重復性好，能夠特異性的擴增出竹柏與長葉竹柏葉綠體基因組，有利于通過葉綠體基因組研究竹柏與長葉竹柏葉的系統進化、親本分析、品種鑒定、系統地理學等。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，更具體地說，涉及竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物及其應用。

背景技術

竹柏(Nageia nagi)和長葉竹柏(Nageia fleuryi)是羅漢松科(Podocarpaceae)集觀賞、藥用、生態為一體的珍稀瀕危植物，廣泛分布在中國南方及日本等地。羅漢松科是松柏類植物中形態分化最為多樣的類群，雖然對其起源與系統發育關系已經有了一定認識，但竹柏類植物的系統進化位置仍存在爭議。葉綠體是綠色植物光合作用的重要場所，作為半自主性細胞器，其基因組具有高度保守的結構和組成，廣泛應用于系統進化、親本分析、品種鑒定、系統地理學等研究。

DNA測序技術的發展對植物分子生物學具有巨大的推動作用。1977年，Sanger發明的雙脫氧核苷酸末端終止法，是第一代測序技術的基石，在此基礎上逐漸發展出以ABI3730xl為代表的第一代測序平臺，使得通過克隆測序或改良后的克隆測序方法獲得葉綠體全基因組成為可能。1986年，煙草(Nicotiana tabacum L.)和地錢(Marchantiapolymorpha L.)葉綠體全基因組序列的公布第一次揭示了葉綠體的結構特征。截止2019年12月，已有上千個物種的葉綠體基因組序列在GenBank上公布，其中包括超過300種作物和林木的葉綠體全基因組，并仍呈快速發展趨勢。

葉綠體基因組序列用于物種的進化研究最早是利用單個基因或者基因間隔的核苷酸多態性進行分析，后來發展為多個基因進行疊加分析，但多個基因的聯合分析不能解決某些進化關系較為復雜的科屬間的分類。Leebens-Mack等提出要想獲得更加精準的系統進化樹要增加基礎分析的數據量即增加物種的葉綠體全基因組序列。葉綠體基因組包含大量的遺傳信息，其大小適中，便于測序，且葉綠體DNA的核苷酸置換率適中，編碼區和非編碼區的分子進化速度有明顯差異等特征可以應用于不同階層的系統學研究。目前，基于序列分析的方法在研究葉綠體系統發育基因組學中的應用較為廣泛，與傳統分子系統學研究方法一致。此外，葉綠體基因組編碼區的信息可以較好的區分較高分類階元的系統進化關系，而葉綠體全基因組的序列比對可以較好的解決較低階元分類群，如亞科下、屬下分類階元等。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明所要解決的技術問題在于提供竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物；本發明所要解決的另一技術問題是提供竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物的應用。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

竹柏和長葉竹柏葉綠體基因組PCR擴增引物，包括29對引物，所述29對引物的核苷酸序列如下：

cpl正向引物如SEQ ID NO.1所示；cp1反向引物如SEQ ID NO.2所示；

cp2正向引物如SEQ ID NO.3所示；cp2反向引物如SEQ ID NO.4所示；

cp3正向引物如SEQ ID NO.5所示；cp3反向引物如SEQ ID NO.6所示；

cp4正向引物如SEQ ID NO.7所示；cp4反向引物如SEQ ID NO.8所示；

cp5正向引物如SEQ ID NO.9所示；cp5反向引物如SEQ ID NO.10所示；