[發明專利]一種電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽探針及制備方法

有效

• 申請號: 202010068364.9
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111057539B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 肖建喜;蔡向東
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C09K11/06;C09K11/02;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04;A61K49/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 韓慧穎

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽探針及制備方法。本發明提供的單鏈膠原多肽探針中間含有(Gly?Pro?Hyp)n、(Gly?Pro?Pro)n或(Gly?Hyp?Hyp)n的重復序列，序列上修飾有熒光信號分子，序列的C端包含數個帶電荷的氨基酸。本發明提供的新型多肽探針不含有非天然氨基酸，制備簡單。該新型多肽探針具有pH敏感性，在酸性條件下形成三重螺旋結構，而在生理pH條件下，則可以保持穩定的單鏈結構，不需要經過任何預處理，即具有特異性結合病變膠原蛋白的能力，并且完全避免了預處理對組織樣品的損傷風險。本發明提供的新型多肽探針，可用于體外檢測病變膠原蛋白的含量，在腫瘤等膠原相關疾病的早期診斷與療效評價中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽功能探針及其制備方法。

背景技術

膠原蛋白作為哺乳動物體內含量最多的蛋白質，是細胞外基質的主要組成成分，在組織形成和維持體內平衡中發揮關鍵作用。人體的正常發育和組織修復中存在膠原重塑的過程，即天然膠原的三螺旋結構在蛋白水解酶或其他外力的作用下會發生形變或降解，若在膠原重塑過程中，膠原產生過多，則過量的膠原會在器官中累積，容易產生組織纖維化，最終導致腫瘤等嚴重疾病；若膠原發生不可控的降解，則會導致膠原蛋白退化性疾病，如關節炎等。因此，如何快速準確的檢測機體組織中的病變膠原蛋白的含量，對于預防和治療膠原蛋白病變相關的疾病具有重要意義。

靶向識別技術是實現腫瘤等疾病的早期檢測和精確診斷的關鍵技術，在生物醫學領域應用廣泛。而膠原蛋白同時參與調控細胞的增殖、分化和遷移等基本生命活動，并與成骨不全癥、關節炎、腫瘤等重大疾病息息相關，可作為人體眾多疾病的關鍵生物標記物。因此，實現對膠原蛋白的靶向檢測對這些疾病的早期診斷和治療至關重要。

目前，對于機體組織中的病變膠原蛋白含量的檢測主要通過抗體抗原免疫法或傳統染料為核心的試劑盒來檢測，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。這些方法可以實現膠原纖維染色，但是，它們通常步驟復雜，染色過程會對組織造成破壞，染色之后的組織不易用于其它染色。并且，這些方法會檢測所有的膠原蛋白，包括正常的膠原蛋白，而不能特異性的專一檢測組織中的病變膠原蛋白。隨著探針技術的不斷進展，目前已發現一些靶向識別膠原蛋白的多肽探針，包括天然氨基酸多肽和非天然氨基酸多肽，可用于體外膠原蛋白的識別及成像。非天然氨基酸多肽的合成成本較高，并且應用于體內檢測會存在安全隱患，因此完全由天然氨基酸組成的多肽探針成為研究熱點。

研究發現，由GPO(Gly-Pro-Hyp)或GPP(Gly-Pro-Pro)重復序列組成的天然氨基酸多肽，可特異性結合病變膠原蛋白。中國專利CN107266562A公開了一種識別病變膠原蛋白的多肽探針，該探針在GPO或GPP的重復序列上修飾熒光物質，在常溫條件下容易形成三重螺旋結構；然而，三重螺旋結構會導致多肽探針喪失膠原蛋白的靶向結合能力。因此，具有三重螺旋結構的多肽探針，必須在使用前進行高溫等前處理，使其保持單鏈狀態，才能夠靶向結合膠原蛋白。但是，高溫等前處理過程容易導致待測組織損傷，會影響檢測結果的準確性。

針對現有技術存在的問題，發明人經過多次試驗研究發現，在含有多個GPO重復序列的多肽上引入數個帶電荷的氨基酸，獲得的新型多肽探針在生理pH環境下具有顯著的單鏈穩定性，而在酸性條件下則形成三重螺旋結構。該多肽序列修飾信號分子后，可作為多肽探針用于病變膠原蛋白的靶向檢測。與現有的膠原靶向的多肽探針相比，該pH敏感的新型多肽探針，在生理條件下，可以保持穩定的單鏈結構，不需要經過任何預處理，即具有特異性結合病變膠原蛋白的能力。該新型多肽探針無非天然氨基酸，制備簡單，而且完全避免了預處理對組織樣品的損傷風險。該新型多肽探針，可用于體外檢測病變膠原蛋白的含量，在腫瘤等膠原相關疾病的早期診斷與療效評價中具有廣闊的應用前景。

發明內容