[發明專利]一種電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽探針及制備方法

有效

• 申請號: 202010068364.9
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111057539B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 肖建喜;蔡向東
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C09K11/06;C09K11/02;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04;A61K49/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 韓慧穎

1.一種電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽功能探針，其特征在于：所述膠原多肽探針的序列為：FAM-Ahx-(GPO)₇-(Asp)₆-NH₂、6-ROX-Ahx-(GPO)₇-(Asp)₆-NH₂、FAM-Ahx-(GPO)₇-(Gly-Asp-Asp)₃-NH₂、FAM-Ahx-(GPO)₇-(Gly-Asp-Asp)₂-NH₂。

2.如權利要求1所述的電荷排斥作用誘導的單鏈膠原多肽功能探針的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

a)將80-250mg的樹脂加入具有篩板的反應器中，使用2-8mL二氯甲烷溶脹樹脂；

b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液脫除N端Fmoc保護基，通過顯色反應來檢測保護基的脫除程度；

c)將N端由Fmoc保護的氨基酸4eq與HOBt 4eq和HBTU 4eq由DMF溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 6eq，溶液混合均勻后加入到反應器中，反應1-6hrs；

d)反應結束后，反應液由反應器中抽出，樹脂分別由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，顯色反應檢測氨基酸縮合完全，樹脂由15-25％哌啶/DMF溶液處理3次，分別為5min、5min和15min，樹脂分別由5mL DMF和DCM洗3次，顯色反應檢測保護基脫除完全；

e)之后重復步驟c)和d)，直到合成目標序列的膠原多肽后，然后向反應器中加入20-30％乙酸酐，顯色反應檢測反應完全后，樹脂分別由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；

f)稱取功能物質4eq、HOBt 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反應12-48hrs；或稱螯合物質4eq、HOBt 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反應12-48hrs；

g)樹脂分別用DCM和甲醇輪流洗滌2-5次，然后將樹脂抽干，加入切割液，切割液的組分為TFA:TIS:水的質量比為95:2.5:2.5，反應1-6hrs；

h)向反應液加入冰乙醚中，將多肽沉淀，然后通過離心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入過量冰乙醚再次沉淀并離心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗滌2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色譜純化得純肽；

i)螯合物修飾肽溶解于緩沖液中，加入到緩沖液溶解的金屬納米功能物質中，肽：功能物質＝1：100，反應2-12hrs；

j)將反應液于緩沖液中透析24-48hrs。