[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010068197.8
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111154900B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳清平;王楚芳;葉青華;古其會;張菊梅;王涓;吳慧清;魏磊;李瀅;丁郁
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）;廣東環(huán)凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;王蘭蘭

本發(fā)明公開了銅綠假單胞菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測方法，本發(fā)明方法提供了用于鑒別銅綠假單胞菌的3個新特異性分子檢測靶標(biāo)，可根據(jù)靶標(biāo)分子設(shè)計相應(yīng)的引物組，并通過對待檢物進(jìn)行PCR，分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果即得到是否存在銅綠假單胞菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可用于檢測某些生化反應(yīng)不敏感的菌株，彌補(bǔ)生化鑒定的缺陷，更加具有實用性；同時本發(fā)明的檢測方法具有操作簡單、檢測時間短、檢測結(jié)果特異性好、結(jié)果判定簡單、成本低等優(yōu)點，對于銅綠假單胞菌識別具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及銅綠假單胞菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測方法。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌屬的模式菌株，是人類重要條件致病菌，該菌可產(chǎn)生多種致病因子，是燒傷、創(chuàng)傷及術(shù)后感染的主要病源菌，還可引起膿毒敗血癥、腦炎腸炎、肺炎和角膜炎等疾病，臨床上銅綠假單胞菌感染非常常見，尤其是導(dǎo)致的肺炎致死率非常高，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時可引起多發(fā)感染、繼發(fā)感染并導(dǎo)致并發(fā)癥，是院內(nèi)感染的第二大病原菌。此外銅綠假單胞菌產(chǎn)生的胞外酶、內(nèi)毒素、毒性極強(qiáng)的外毒素等十余種致病因子也具有極大的危害性。因此，對銅綠假單胞菌建立健全快速準(zhǔn)確的檢測體系很有必要。

大部分監(jiān)檢機(jī)構(gòu)現(xiàn)行的檢測方法依舊是采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法。但傳統(tǒng)生化鑒定需要約48h增菌，然后進(jìn)行24~48 h顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)和進(jìn)一步的生化鑒定，檢驗周期大約需要一周或者更長時間，檢驗步驟繁瑣、耗時長，還有可能結(jié)果不準(zhǔn)確，比如我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB8538—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法》中依據(jù)產(chǎn)生藍(lán)/綠色菌落判定為是銅綠假單胞菌，而在實際中惡臭假單胞菌在相同條件下也產(chǎn)生藍(lán)/綠色，因此對可疑菌落產(chǎn)生色素進(jìn)行判定計數(shù)可能出現(xiàn)假陽性；該標(biāo)準(zhǔn)中除了將產(chǎn)藍(lán)/綠色、產(chǎn)熒光、紅褐色之外的其他菌落判定為非銅綠假單胞菌，但是研究表明有少許銅綠假單胞菌不產(chǎn)色素，這就有可能出現(xiàn)陽性結(jié)果不夠準(zhǔn)確。此外應(yīng)用生化試驗鑒定銅綠假單胞菌，生化反應(yīng)不穩(wěn)定，鑒定結(jié)果重復(fù)性差，也容易造成誤判。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以PCR為主的分子生物學(xué)檢測方法以其快速、準(zhǔn)確、簡便的特點，逐漸成為取代傳統(tǒng)檢測方法最具潛力的檢測技術(shù)之一。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)SN/T2206.12-2014 《化妝品微生物檢驗方法第 12部分：綠膿桿菌PCR法》就是把銅綠假單胞菌的外毒素A基因保守片段為目標(biāo)片段，設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，對化妝品中的銅綠假單胞菌進(jìn)行快速檢測。此外，國內(nèi)外PCR檢測方法對銅綠假單胞菌分子檢測靶標(biāo)及引物已有一些的報道，常見的特異性基因有SyrB、toxA、I6S-23S、l6SrDNA、oprl、oprL、fliC、ecfX、oprL、ecfX+gyrB、ETA、opr、exoU、exoS等，在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，隨著臨床治療過程中銅綠假單胞菌變異菌株和耐藥菌株的不斷發(fā)現(xiàn)，基于原有的以毒力因子為檢測靶點建立的分子檢測方法因靶點易缺失、數(shù)量有限導(dǎo)致方法不夠準(zhǔn)確，此外銅綠假單胞菌分子靶標(biāo)數(shù)量有限、特異性靶標(biāo)少，使得銅綠假單胞菌的精準(zhǔn)鑒定面臨了巨大的挑戰(zhàn)。尋找新型特異性靶標(biāo)分子用于銅綠假單胞菌快速、精確檢測具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供用于鑒別銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）的特異性新分子靶標(biāo)及相應(yīng)的PCR檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：本發(fā)明要求保護(hù)一組用于鑒別銅綠假單胞菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.3所示。