[發(fā)明專(zhuān)利]一種靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010067614.7
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111239386B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈國(guó)民;劉紅麗;劉浩;沈滟;曹青;高蒙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/543
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/543;C12Q1/26;A61K31/502;A61P7/02;A01N43/58;A01P11/00
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛(ài)周

本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ?谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法及應(yīng)用，屬于分子細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建維生素K循環(huán)小分子抑制劑篩選體系，可以快速對(duì)藥物小分子庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，得到靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物；進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)小分子化合物對(duì)VKOR蛋白活性的抑制作用，并用VKORC1和VKORC1L1基因雙敲除細(xì)胞系對(duì)篩選出的小分子化合物進(jìn)行鑒定，可以得到靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ?谷氨酰羧化酶(VKGC)的小分子化合物。采用該方法，本發(fā)明首次篩選到一個(gè)特異性抑制維生素K依賴(lài)性γ?谷氨酰羧化酶的小分子化合物，該小分子可用于研究VKGC蛋白的生化特性，具有開(kāi)發(fā)為滅鼠藥和抗凝藥物的潛在應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法及應(yīng)用，屬于分子細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素K在血液正常凝固中發(fā)揮重要作用，主要用于防止新生嬰兒出血疾病、預(yù)防內(nèi)出血以及維生素K拮抗劑的解毒劑。維生素K通過(guò)調(diào)節(jié)一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻譯后修飾參與凝血(如圖1所示)。維生素K依賴(lài)性凝血因子的Gla結(jié)構(gòu)域的谷氨酸殘基γ羧基化修飾是其發(fā)揮凝血功能的必要條件。維生素K在這一翻譯后修飾過(guò)程中發(fā)揮核心作用，并以三種形式在體內(nèi)循環(huán)，分別是維生素K環(huán)氧化物(KO)、維生素K(K)和二氫維生素K(KH₂)。

目前已知兩個(gè)酶在維生素K循環(huán)中發(fā)揮作用。其中維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)利用KH₂為輔因子，對(duì)維生素K依賴(lài)性凝血因子的Gla結(jié)構(gòu)域的谷氨酸殘基進(jìn)行γ羧基化修飾，同時(shí)把KH₂轉(zhuǎn)化成KO。為了使VKGC的催化反應(yīng)可以持續(xù)進(jìn)行，KO必須被還原成KH₂，而這一反應(yīng)主要是由具有KO還原酶活性和K還原酶活性的維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)催化的。VKOR催化KO到K，以及K到KH₂，使維生素K可以循環(huán)利用。研究表明，VKOR是臨床抗凝血藥物華法林(warfarin)的特異性作用靶點(diǎn)，華法林通過(guò)抑制VKOR的活性，使KO不能轉(zhuǎn)化為K和KH₂，從而阻斷了維生素K循環(huán)，進(jìn)而抑制凝血因子Gla結(jié)構(gòu)域的谷氨酸殘基的γ羧基化修飾，達(dá)到抗凝血的目的。此外，殺鼠藥溴敵隆也是特異性靶向VKOR的抑制劑。

維生素K循環(huán)的關(guān)鍵酶(VKOR和VKGC)是開(kāi)發(fā)抗凝血藥物(或殺鼠藥)的重要靶點(diǎn)，然而目前還沒(méi)有報(bào)道特異性靶向VKGC的小分子化合物及其篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種通過(guò)上述方法篩選出的小分子化合物作為制備靶向維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的抑制劑的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，包括以下步驟：

1)篩選靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物

將待選小分子化合物加入到含有維生素K的雙報(bào)告基因細(xì)胞體系培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物；

所述雙報(bào)告基因細(xì)胞體系中含有同時(shí)表達(dá)FIX-Gla-PC融合基因和報(bào)告基因的質(zhì)粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)篩選對(duì)VKOR蛋白活性無(wú)抑制作用的小分子化合物

對(duì)篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物進(jìn)行VKOR蛋白活性抑制測(cè)定，篩選出對(duì)VKOR蛋白活性無(wú)抑制作用的小分子化合物；

3)篩選靶向抑制維生素K依賴(lài)性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物