[發(fā)明專利]一種靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010067614.7
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111239386B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設計）人: 沈國民;劉紅麗;劉浩;沈滟;曹青;高蒙
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C12Q1/26;A61K31/502;A61P7/02;A01N43/58;A01P11/00
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)篩選靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物

將待選小分子化合物加入到含有維生素K的雙報告基因細胞體系培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，篩選出靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物；

所述雙報告基因細胞體系中含有同時表達FIX-Gla-PC融合基因和報告基因的質粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)篩選對VKOR蛋白活性無抑制作用的小分子化合物

對篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物進行VKOR蛋白活性抑制測定，篩選出對VKOR蛋白活性無抑制作用的小分子化合物；

3)篩選靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物

用VKORC1和VKORC1L1基因雙敲除的、同時表達FIX-Gla-PC融合基因的細胞系對篩選出的小分子化合物進行鑒定，得到靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物；

步驟2)中，VKOR蛋白活性抑制測定的方法如下：

將篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物與維生素K環(huán)氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入熒光測量板中，用熒光檢測儀檢測熒光，設定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，

將篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物與維生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入熒光測量板中，用熒光檢測儀檢測熒光，設定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；

所述維生素K環(huán)氧化物工作液的配制方法為：分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液3，配制得到GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K環(huán)氧化物濃度為30-80μmol/L的維生素K環(huán)氧化物工作液；

所述維生素K工作液的配制方法為：分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液4，配制得到GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K濃度為30-80μmol/L的維生素K工作液；

所述VKOR蛋白工作液的配制方法為：分別取VKOR蛋白和緩沖液1，配制得到VKOR蛋白濃度為1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；

緩沖液1的組成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶劑為水；

緩沖液2的組成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶劑為水；pH值7.0-7.6；

緩沖液3的組成包括：維生素K環(huán)氧化物1-50mmol/L，溶劑為異丙醇；

緩沖液4的組成包括：維生素K1-100mmol/L，溶劑為異丙醇。

2.根據(jù)權利要求1所述的靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述雙報告基因細胞體系的宿主細胞為人胚腎細胞293Trex。

3.根據(jù)權利要求1所述的靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述報告基因為甲蟲熒光素酶報告基因，甲蟲熒光素酶報告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據(jù)權利要求1所述的靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述同時表達FIX-Gla-PC融合基因和報告基因的質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根據(jù)權利要求1所述的靶向抑制維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述雙報告基因細胞體系培養(yǎng)液中維生素K的濃度為1～20μmol/L。