[發(fā)明專利]一種靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010066656.9
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111139240B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳宇;嚴(yán)鯤;馮姜澎;劉杏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)及其應(yīng)用。根據(jù)CRISPR的gRNA的設(shè)計(jì)原則及不同基因型HBV序列的保守性區(qū)域，篩選3條gRNA并構(gòu)建在PX601表達(dá)載體上，同時(shí)選擇不同肝臟特異性啟動(dòng)子與HBV病毒基因組的增強(qiáng)子進(jìn)行組合，篩選出2個(gè)啟動(dòng)子組合對(duì)表達(dá)載體PX601進(jìn)行改造。在細(xì)胞模型和小鼠模型中利用上述gRNA指導(dǎo)的CRISPR改造系統(tǒng)，可以在顯著提升SaCas9的肝組織表達(dá)特異性的同時(shí)，有效的抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)和復(fù)制。該系統(tǒng)易于操作、安全性高、對(duì)HBV復(fù)制的抑制效率高。該改造的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)有望成為治療乙型肝炎病毒新型治療藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及對(duì)能夠被腺相關(guān)病毒(AAV)載體遞送的CRISPR/SaCas9核酸酶系統(tǒng)的改造，選取高效且更具安全性的肝臟特異性表達(dá)SaCas9核酸酶的啟動(dòng)子組合，并針對(duì)多種基因型和亞型的乙型肝炎病毒保守序列，設(shè)計(jì)、構(gòu)建、篩選最優(yōu)的指導(dǎo)RNA及其靶位點(diǎn)序列。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種能引起患者慢性感染，增加肝硬化和肝癌風(fēng)險(xiǎn)的病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有2.91億人口感染乙型肝炎病毒，每年約有100萬(wàn)人因?yàn)橐倚透窝准捌湟l(fā)的肝硬化和肝癌失去生命。因此，病毒性乙型肝炎是威脅全球健康的一個(gè)重要問(wèn)題。核苷(酸)類似物(NUCs)和干擾素(IFN)是目前治療HBV僅有的兩類藥物，然而這兩類藥物均無(wú)法清除穩(wěn)定存在于細(xì)胞核中且能夠作為模板產(chǎn)生子代病毒的閉合共價(jià)環(huán)狀DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)，此外，HBV耐藥相關(guān)突變(RAM)和疫苗逃逸突變(VEM)也降低了現(xiàn)有治療和預(yù)防策略的成功率。因此，人們?cè)谂﹂_(kāi)發(fā)直接靶向cccDNA，將之失活或清除以實(shí)現(xiàn)治愈慢性乙肝的治療手段。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng),根據(jù)行使功能的蛋白組成作用方式不同分為兩類，六種型。其中Ⅱ類系統(tǒng)的Type Ⅱ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)的DNA內(nèi)切酶Cas9只有一個(gè)亞基，結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單，所以應(yīng)用也最廣泛。除了Cas9蛋白外，該系統(tǒng)還包括兩條短的CRISPR RNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA復(fù)合體可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)指導(dǎo)Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif)附近特異性剪切DNA雙鏈，形成DSB(double strandbreak)。DSB可以通過(guò)兩種途徑被修復(fù)，一種是非同源重組的末端接合(Non-HomologousEnd Joining NHEJ)DNA修復(fù)方式，另一種是同源重組修復(fù)(Homology Directed RepairHDR)方式。

特異性靶向HBV基因組保守區(qū)域的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅能夠有效抑制病毒復(fù)制，相比其他基因編輯工具，設(shè)計(jì)也更加簡(jiǎn)單靈活，成為了一個(gè)十分具有吸引力的治療選擇。目前已經(jīng)有大量的研究證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效抑制HBV的復(fù)制^[1-6],但真正將其投入到治療應(yīng)用之前,還需要解決幾個(gè)重要的問(wèn)題：首先是如何高效安全的遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)；其次是關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，CRISPR/Cas9在識(shí)別并切割靶位點(diǎn)的同時(shí)，也可能對(duì)與靶位點(diǎn)相似的DNA序列同樣進(jìn)行切割。