[發(fā)明專利]一種靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010066656.9
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN111139240B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳宇;嚴(yán)鯤;馮姜澎;劉杏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種基于CRISPR/SaCas9系統(tǒng)能夠特異性抑制HBV復(fù)制的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的靶點(diǎn)核苷酸序列如SEQ ID NO：4或5所示。

2.一種含有SaCas9肝臟特異性啟動(dòng)子組合和權(quán)利要求1所述gRNA分子的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)，其特征在于，所述SaCas9肝臟特異性啟動(dòng)子組合為核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的Enh2-PPck或Enh2-Pa1AT，所述CRISPR/SaCas9系統(tǒng)以PX601為表達(dá)載體，用SaCas9肝臟特異性啟動(dòng)子組合對(duì)表達(dá)載體的CMV啟動(dòng)子進(jìn)行替換得到替換了啟動(dòng)子的PX601表達(dá)載體，將權(quán)利要求1所述gRNA分子與替換了啟動(dòng)子的PX601表達(dá)載體相連接。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)，其特征在于，所述將權(quán)利要求1所述gRNA分子與替換了啟動(dòng)子的PX601表達(dá)載體相連接為先在所述gRNA分子的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互補(bǔ)鏈的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分別合成正向和反向寡核苷酸序列，然后將合成的序列變性、退火，得到具有BbsI粘性末端的雙鏈DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

N表示A、G、C和T，將雙鏈DNA片段和用BbsI酶切過的替換了啟動(dòng)子的PX601表達(dá)載體進(jìn)行連接。

4.權(quán)利要求2或3所述的CRISPR/SaCas9系統(tǒng)在制備治療乙肝藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物中包含一種或多種權(quán)利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系統(tǒng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CRISPR/SaCas9系統(tǒng)被包裝于AAV8血清型重組腺相關(guān)病毒基因組中。

6.一種含有一種或多種權(quán)利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系統(tǒng)的組合物，其特征在于，所述組合物含有制藥學(xué)上可接受的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物被制備為注射劑。

8.一種非診斷或治療目的的抑制HBV復(fù)制的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將權(quán)利要求2或3所述一種或多種CRISPR/SaCas9系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞或者生物體中；以及

(2)表達(dá)權(quán)利要求2或3所述一種或多種CRISPR/SaCas9系統(tǒng)，并在所表達(dá)的導(dǎo)向RNA和SaCas9核酸酶共同作用下，破壞共價(jià)閉合環(huán)狀DNA。