[發明專利]一種肺癌細胞株突變文庫及其構建方法

有效

• 申請號: 202010065207.2
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111154804B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 常德;D·查爾斯;S·羅克什
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第三醫學中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種肺癌細胞株突變文庫及其構建方法，屬于基因突變技術領域。本發明提供了一種肺癌細胞株突變文庫的構建方法：1)用CAG?tTA質粒轉染人肺癌細胞株，獲得穩定表達且受四環素調控的轉錄激活因子的Tet?off細胞株；2)將基因搜尋載體和有效表達轉座酶MPB的質粒，共轉染步驟1)獲得的Tet?off細胞株，獲得全基因組純合細胞突變體；所述基因搜尋載體的轉染劑量為500ng/10⁵個細胞，所述有效表達轉座酶MPB的質粒的轉染劑量為125ng/10⁵個細胞。本發明可用于肺癌相關基因的篩選。

技術領域

本發明具體涉及一種肺癌細胞株突變文庫及其構建方法，屬于基因突變技術領域。

背景技術

近年來，肺癌細胞株突變文庫的構建方法包括RNAi干擾技術、cDNA文庫技術、CRISPR技術和插入突變技術等。RNA干擾技術是近年發展的一項新的基因沉默技術，可利用siRNA或siRNA表達載體快速、經濟、簡便的以序列特異方式剔除或關閉特定基因的表達，借助siRNA表達文庫可進行高通量篩選，發現新的功能基因。然而，該技術在設計沉默靶基因的dsRNA時，需提前獲知靶基因的序列，無法篩選一些未知基因或序列；另外，RNAi技術只能下調靶基因的表達，無法過表達基因，往往需配合cDNA文庫篩選，這也限制了其應用，但仍不能篩選到未知基因或序列。cDNA文庫技術和CRISPR技術也需要提前預知靶基因的序列，也只能單向上調或下調基因。插入突變是常利用轉座子攜帶外源DNA序列作為標記，破壞基因的結構而導致突變，可以直接驗證個別基因與所篩選性狀之間關系，然而人類是二倍體生物，存在兩個等位基因，當其中一個等位基因結構破壞而不能正常表達時，而同源染色體上另一個等位基因仍正常表達，以致無法使該基因失活。

發明內容

本發明提供了一種肺癌細胞株突變文庫的構建方法，步驟如下：

1)用CAG-tTA質粒轉染人肺癌細胞株，獲得穩定表達且受四環素調控的轉錄激活因子的Tet-off細胞株；

2)將基因搜尋載體和有效表達轉座酶的質粒，共轉染步驟1)獲得的Tet-off細胞株，獲得全基因組純合細胞突變體；

所述基因搜尋載體的轉染劑量為500ng/10⁵個細胞，所述有效表達轉座酶的質粒的轉染劑量為125ng/10⁵個細胞；

所述基因搜尋載體包含四環素反應元件、piggyBac轉座子、新霉素抗性基因和質粒復制起點，所述四環素反應元件通過兩段四環素反應元件拼接得到；所述有效表達轉座酶的質粒為MPB。

進一步地限定，步驟1)中所述的人肺癌細胞株為人肺癌A549細胞株。

本發明還提供了上述構建方法獲得的肺癌細胞株突變文庫。

有益效果

該肺癌細胞突變文庫含有全基因組隨機突變基因，該種基因突變可通過添加四環素DOX來調控，而且該種調控是一種變阻器式調控，即突變基因的表達水平隨添加的四環素DOX濃度變化而變化。本發明可用于肺癌發生、耐藥、轉移等關鍵致病基因的篩選。

附圖說明

圖1Tet-off克隆的篩選，橫坐標為Tet-off克隆編號，縱坐標為調控倍數；

圖2候選4個Tet-off克隆細胞株受DOX調控特性比較，橫坐標為Tet-off克隆編號，縱坐標為調控倍數；

圖3#4和#5克隆受DOX變阻器式調控的檢測，橫坐標為四環素濃度(ng/mL),縱坐標為相對光單位；

圖4基因搜尋載體GSV和轉座酶mPB共轉染量的摸索；

圖5GSV插入位點的偏好性，bits代表保守位點。

具體實施方式