[發(fā)明專利]一種肺癌細(xì)胞株突變文庫及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010065207.2
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111154804B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 常德;D·查爾斯;S·羅克什
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種肺癌細(xì)胞株突變文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，肺癌細(xì)胞突變文庫含有全基因組隨機突變基因，突變基因的表達(dá)水平隨添加的四環(huán)素DOX濃度變化而變化；

該文庫的構(gòu)建方法步驟如下：

1)用CAG-tTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定表達(dá)且受四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子的Tet-off 細(xì)胞株；

2)將基因搜尋載體和有效表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染步驟1)獲得的Tet-off細(xì)胞株，獲得全基因組純合細(xì)胞突變體；

所述基因搜尋載體的轉(zhuǎn)染劑量為500ng/10⁵個細(xì)胞，所述有效表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量為125ng/10⁵個細(xì)胞；

所述基因搜尋載體包含四環(huán)素反應(yīng)元件、piggyBac轉(zhuǎn)座子、新霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制起點，所述四環(huán)素反應(yīng)元件通過兩段四環(huán)素反應(yīng)元件拼接得到；所述有效表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒為MPB；

共轉(zhuǎn)染GSV，500ng和mPB，125ng至10⁵個細(xì)胞，經(jīng)G418篩選3周后，隨機挑選單克隆細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組DNA，利用Splinkette PCR方法定位基因，共挑選102個單克隆，突變基因如下表所示：RAPGEF4、RGPD5、MTAP、 BRINP3、CDKN2A、AMOTL1、AVRC1、VMP1、MSH3、HSPA8、TCERG1、SMAD3、NF2、CSMD3、CSGALNACT1、ARID5B、SH2D4A、MIR31HG、KREMEN1、ARHGAP26、ASB4、PTPR、PCAT1、NCOA2、ABTB2、HEXIM2、LNCAROD、ATXN2、 PRKG1、GRM5、FXYD4、NUBPL、GRB10、PEAK1、MALAT1、SPR68、LPAR3、AC137630.1、ARID5B、PKM、GPRIN3、LINC01322、SLC13A1、RNF103-CHMP3、VMP1、GDF15、BCL2L13、AC103718.1、VMP1、VMP1、ZFX、SEPT10、ALDH3B1、RTTN、MYOF、HSP90AB1、HIST1H2BJ、ALDH3B1、ARRB2、OXR1、SEMA3C、GRID2、VMP1、VMP1、VMP1、ITPRID2、PECR、MIPOL2、AC007950.1、ST7、HSP90AA1、ARHGEF28、NEDD9、DDX60L、DCC、RAB28、AC239584.1、NFIB、PIP5K1A、VMP1、C11orf74、ASPH、PTPN14、LINC00592、SQSTM1、LINC00592、AC091212.1、VMP1、NKAIN3、VMP1、ALDH1A1、ZNF260、AP000676.3、MKLN1、LINC00535、COX412、SESN3、LMCD1-AS1 、KDR、AC090204.1、KCNK3、EYS、LINC01985、DNAJB6、IQCH、PALLD、AL033397.1、MMP15、SLC7A11、RPL39L、IGF1R、MAP3K7、IGF1R、ARL8B、AC096711.3、AC025524.2、NCALD、WDR63、SSBP2、HLCS、CYP24A1、AC068413.1、MACROD2、AC011483.1、ABCC4、VMP1、PDE4D、FUT8、ITGB1-DT、CAMK2D、LINC02561、ANXA2、PLXDC2、PPP1R9A、PED4D、AC005537.1、VMP1、TP63、TP63、MLPH、AC091212.1、PDE4D、MYO7B、LOC105371458、KMT5A、TOM1L1、AC087190.2、AC012368.2、HIF1A-AS2、FOXN2、AC092115.3、FAM19A2、KANTR、ATXN10、AP001464.1、PLSCR4、TPX2、METTL16、MTDH、GFRA2、VMP1 。