[發明專利]一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010064860.7
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111110654B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 關新剛;夏薇;王冬梅
• 申請（專利權）人: 北華大學
• 主分類號: A61K9/51
• 分類號: A61K9/51;A61K38/16;A61K47/42;A61P35/00;C07K19/00;C07K1/14;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒及其制備方法和應用；制備方法為：根據pET25b(+)?HSP16.5表達載體的基因序列，合成促凋亡肽KLAK肽對應的單鏈DNA序列，退火處理后產物與載體進行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收酶切產物，將KLAK序列與載體連接，連接產物轉化至DH5a大腸桿菌感受態中，挑取單克隆菌落過夜搖菌，提取質粒測序；將測序正確的pET25b(+)?HSP?KLAK質粒轉化至BL21大腸桿菌感受態中，擴大培養，超聲破碎菌體得到相應粗產物，然后純化，透析濃縮凍干后得到HSP?KLAK蛋白；本發明的攜帶抗腫瘤肽的熱休克蛋白納米顆粒可以被腫瘤細胞快速攝取，在溶酶體中釋放后，靶向線粒體發揮腫瘤殺傷功能，而藥物載體本身蛋白質可被細胞快速降解，達到良好的腫瘤治療效果。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒及其制備方法和應用。

背景技術

癌癥，又稱惡性腫瘤，是由于多因素引發、多基因突變、多階段發展的多發病，傳統化療藥物在臨床使用過程中產生的嚴重毒副作用和腫瘤細胞的多重耐藥性等問題嚴重限制了它們在腫瘤治療中的應用。

多肽是由少量氨基酸(10～100個)組成的小“蛋白”，具有分子量小、易改造修飾、結構清楚、作用機制明確、活性接近蛋白等優點，集化學藥和蛋白藥優勢于一身，因此成為當前抗癌藥研發的熱點領域之一。

抗腫瘤肽(KLAKLAK)2(KLAK)是一種合成的抗菌肽，只對腫瘤細胞有殺傷作用，研究發現其可在表面形成具有陽離子氨基酸的α-螺旋，破壞真核線粒體膜和原核膜的完整性，使細胞程序性死亡。但由于親水性，使其不能有效內化到腫瘤細胞中，所以它必須與細胞穿透部分的受體或配體偶聯，通過受體非依賴性和依賴性機制進入靶細胞，才能發揮促凋亡特性。

因此，對游離肽進行改造和修飾，開發一種有效進入腫瘤細胞、增強藥物對腫瘤細胞的殺傷特性和降低藥物的毒副作用的抗腫瘤藥物變得尤為重要。

發明內容

針對上述問題，本發明旨在提供一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒及其制備方法和應用，本發明的攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒可以被腫瘤細胞快速攝取，在溶酶體中釋放后靶向線粒體發揮腫瘤殺傷功能，而藥物載體本身蛋白質可被細胞快速降解，達到良好的腫瘤治療效果。

為了達到上述的目的，本發明所采用的技術方案是：

一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒，具體為HSP-KLAK納米顆粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。

進一步的，所述HSP-KLAK納米顆粒的粒徑為35-45nm。

進一步的，所述攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

(1)pET25b-HSP16.5-KLAK表達載體的構建：

A：合成KLAK的DNA片段：

上游引物：

5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG 3’；

下游引物：

5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG 3’；

根據上述序列，合成單鏈DNA片段，通過PCR反應擴增得到KLAK的DNA片段；