[發明專利]一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010064860.7
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111110654B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 關新剛;夏薇;王冬梅
• 申請（專利權）人: 北華大學
• 主分類號: A61K9/51
• 分類號: A61K9/51;A61K38/16;A61K47/42;A61P35/00;C07K19/00;C07K1/14;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.一種攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒，其特征在于，具體為HSP-KLAK納米顆粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。

2.根據權利要求1所述攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒，其特征在于，所述HSP-KLAK納米顆粒的粒徑為35-45nm。

3.根據權利要求1所述攜帶抗腫瘤肽的蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)pET25b-HSP16.5-KLAK表達載體的構建：

A：合成KLAK的DNA片段：

上游引物：

5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG 3’；

下游引物：

5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG 3’；

根據上述序列，合成單鏈DNA片段，通過PCR反應擴增得到KLAK的DNA片段；

B：將KLAK的DNA片段和載體pET25b-HSP16.5分別進行雙酶切，然后核酸電泳，凝膠回收得到酶切產物，將酶切后的KLAK的DNA片段和酶切后的載體pET25b-HSP16.5進行連接，構建重組質粒；

C：將所述重組質粒轉化入DH5a大腸桿菌感受態細胞中，進行氨芐抗性篩選，然后測序，測序正確的重組質粒為pET25b(+)-HSP-KLAK質粒；

(2)pET25b(+)-HSP-KLAK質粒表達菌株的構建：將pET25b(+)-HSP-KLAK質粒轉化至BL21大腸桿菌的感受態細胞中，并將轉化后的菌株保存于甘油；

(3)pET25b(+)-HSP-KLAK質粒在BL21大腸桿菌中的誘導表達及純化：A：誘導表達：將步驟(2)制得的菌株接種于LB中培養，通過IPTG誘導表達，誘導4h-6h，然后離心分離，得上清液和沉淀，分別通過SDS-PAGE全蛋白電泳，HSP-KLAK蛋白表達成功的為HSP-KLAK蛋白包涵體沉淀；

B：純化：收集步驟A中HSP-KLAK蛋白包涵體沉淀，繼續離心去上清液，添加包涵體洗滌液洗滌兩次，離心去上清液，然后添加包涵體裂解液，冰浴過夜，制得裂解蛋白液，將其離心留上清液，加入蛋白復性液，制得復性蛋白液，最后透析濃縮后凍干，取凍干蛋白進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白質純度及分子量，制得HSP-KLAK納米顆粒。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中步驟A的PCR反應包括以下步驟：將Nuclease-Free Water，DNA寡核苷酸退火緩沖液以及上游引物和下游引物依次混合，于95℃條件下退火5min，緩慢冷卻至室溫，制得KLAK的DNA片段。

5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中步驟B雙酶切所用的核酸內切酶是Hind III和Xho I。

6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中步驟B的包涵體洗滌液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl和2M尿素，包涵體洗滌液的pH為8.0。

7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中步驟B的包涵體裂解液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl和8M尿素；包涵體裂解液的pH為8.0。

8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中步驟B的蛋白復性液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15mM NaCl，1M尿素，0.15M L-Arg，2m M GSH和0.5m M GSSG；Tris-HCl的pH為8.0，蛋白復性液的pH為8.0。